דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic

Published: January 13th, 2018

DOI:

10.3791/56712

Kerstin Hadamek^1,2, Angelika Keller^1,2, Antje Gohla^1,2

¹Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, ²Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

אנו מתארים הנועד במבחנה דגם chorioallantoic מצורף, בשלב הראשון של היווצרות השליה. הפרוטוקול מדגים התרבות לנתיחה, explant של allantoides מאתר על קיבוע α4β1 אינטגרין. קובץ מצורף allantois מוערך ברמה המיקרוסקופית בנקודות זמן שנקבע מראש.

השליה היא חיונית עבור הצמיחה וההתפתחות של עוברי יונקים. מסיבה זו, רבים שינויים גנטיים ועלבונות סביר גם סביבתי זה להפריע התפתחות השליה או לפונקציה יכול לגרום לאבדן הריון מוקדם בעכברים ובבני אדם. למרות זאת, פשוט במבחנה מבחני על המסך עבור תופעות אפשריות על היווצרות השליה חסרים. כאן, אנו מתמקדים מידול הצעד הראשון וקריטיים היווצרות השליה, אשר מורכב הקובץ המצורף של allantois chorion. אנו מתארים שיטה להעריך במהירות את הקובץ המצורף של explants allantoic על α4β1 קיבוע אינטגרין, המשמש מצע chorio-מימטי. גישה זו במבחנה מאפשרת הערכה איכותית של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובים בנקודות זמן שונות ברציפות. הפרוטוקול עשוי לשמש כדי לחקור את ההשפעה של העכבר יישוב מוטציות, סמים או גורמים סביבתיים שונים, אשר קושרו הריון סיבוכים או אובדן העובר על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

השליה היא הכרחית לצמיחה עובריים ופיתוח בסביבת הרחם. היא מהווה את הממשק חמצן, מטבוליט של exchange התזונתי בין מחזור הדם העוברי, אימהית, גם פונקציות כמו איבר האנדוקרינית ו. כל עלבון אנדוגני או אקסוגני זה פוגע פיתוח היפרדות יכול להוביל פיגור גדילה תוך רחמי, אובדן עוברית או סיבוכים בהריון, בעכברים והן בני אדם¹. בעוד המספר של העכבר יישוב מוטציות הגורמות פיזיולוגיה היפרדות חריג ממשיך לגדול², עם אחרים 219 שמפורט כרגע באתר מידענות הגנום העכבר (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), שרבים פנוטיפים אלה אינם מובנים היטב מנקודת מבט מכניסטית. בנוסף שינויים גנטיים, מולקולה קטנה סמים, נוגדנים חד-שבטיים, ....

העכבר הרבייה אושרה על-ידי Regierung Unterfranken ולאחר כל הבדיקות בוצעו בהתאמה קפדנית עם האיחוד האירופי וגרמנית כל החוקים והתקנות החלים לגבי טיפול ושימוש של חיות מעבדה.

1. ציפוי של Microtiter צלחות עם אינטגרין α4β1 לתרבות Explant של הרחם לשעבר Allantois

לשקם את אינטגרין α4β1 מאתר lyophilized-µg/m.......

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד, explant allantoides מאתר ex-vivo, ומפרט את ההערכה איכותי של הקובץ המצורף allantois α4β1 אינטגרין, תהליך קריטי במהלך ויוו chorioallantoic פיוז'ן. התוצאות נציג באיור איור 1A–H מדגימים את השלבים רצופים של בידוד allantois החל מהרחם ב?.......

בנוכחות סרום, המהווה מקור עשיר של מולקולות פרו-דבק מטריצה חוץ-תאית כגון fibronectin, allantois explants ייצמד בקלות שונים פלסטיק, זכוכית או מסנן משטחים⁹^,¹⁶. לפיכך, אם מטרת וזמינותו שבוצעו היא לחקור באופן ספציפי את האפקט של שינוי גנטי או כל טיפול אחר על הקובץ המצורף allantois מתא?.......

עבודה זו נתמכה על ידי SFB688 פתוח דויטשה (ל א).

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca²⁺ and Mg²⁺.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO₃ but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.

Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: