Рассечение и экспланта культуры мышиных Аллантоис для анализа в пробирке Allantoic вложения

Published: January 13th, 2018

DOI:

10.3791/56712

Kerstin Hadamek^1,2, Angelika Keller^1,2, Antje Gohla^1,2

¹Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, ²Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

Мы описываем в vitro пробирного модель chorioallantoic насадку, первый шаг в формировании плаценты. Протокол показывает вскрытие и экспланта культуры мышиных allantoides на иммобилизованных α4β1 Интегрин. Аллантоис вложений оценивается микроскопически в предопределенное время точках.

Плацента имеет важное значение для роста и развития у млекопитающих эмбрионов. По этой причине многие генетические изменения и вероятно также экологические оскорбления, которые мешают развитию плаценты или функция может привести к ранней потери беременности мышей и людей. Тем не менее хватает простой в vitro анализов для потенциального воздействия на формирование плаценты. Здесь мы сосредоточены на моделирование первый и критический шаг в формирования плаценты, которая состоит из приверженность Аллантоис хориона. Мы описываем метод, чтобы быстро оценить вложение allantoic эксплантов на иммобилизованных α4β1 Интегрин, который служит Хорио подражательный субстрата. Этот подход в vitro позволяет качественной оценки вложения и распространение поведение нескольких Аллантоис эксплантов в точках различных раз подряд. Протокол может использоваться для исследовать эффект целевой мыши мутации, наркотиков или различных экологических факторов, которые были связаны с осложнений беременности или потери плода на Аллантоис вложение ex vivo.

Плацента является необходимым для эмбрионального роста и развития в условиях матки. Это представляет собой интерфейс для кислорода, метаболит и питательных обмен между обращения матери и плода, а также функции как эндокринной и иммунной орган. Любое эндогенного или экзогенного оскорбление, которое препятствует плацентарный развития может привести к внутриутробного развития, потери плода или осложнений беременности, мышей и людей¹. В то время как количество целевых мыши мутаций, которые вызывают аномальные плаценты физиологии продолжает расти², с 219 генотипов, в настоящее время перечислены на веб-сайте информатики генома....

Разведение мыши был одобрен Regierung Унтерфранкен, и все анализы проводились в строгом соответствии с немецкого и Европейского союза применимые законы и правила, касающиеся ухода и использования лабораторных животных.

1. покрытие микротитровальных плиты с α4β1 Интегрин Ex Ut.......

Этот протокол описывает метод для изоляции и explant мышиных allantoides ex vivoи деталей качественной оценки Аллантоис привязанность к α4β1 Интегрин, критический процесс во время в vivo chorioallantoic фьюжн. Представитель результаты, показанные на рисунке 1A.......

Присутствии сыворотки, которая является богатым источником про клей внеклеточного матрикса молекул, например, фибронектин, Аллантоис эксплантов будет легко прикрепить различные пластика, стекла или фильтр поверхности⁹^,¹⁶. Таким образом если цель выполн?.......

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (чтобы а.г.).

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca²⁺ and Mg²⁺.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO₃ but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.

Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: