JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Medicine

Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve

Published: January 13th, 2018

DOI:

10.3791/56712

1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, 2Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

Biz bir vitro tahlil modeli chorioallantoic ekte, plasenta oluşumu ilk adımda açıklanmaktadır. Protokol immobilize α4β1 Integra üzerinde fare allantoides diseksiyon ve explant kültür gösterir. Allantois ek olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarda değerlendirilir.

Plasenta büyüme ve memeli embriyo gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, çok sayıda genetik değişiklikler ve plasenta geliştirme veya işlev rahatsız büyük olasılıkla aynı zamanda çevre hakaret erken gebelik kaybı fareler ve insanlar neden olabilir. Yine de, basit vitro deneyleri plasenta oluşumu üzerindeki olası etkileri için ekran için eksik vardır. Burada, allantois ekin için koryon oluşur plasenta oluşumu ilk ve önemli adımda modelleme ele. Biz hızla allantoic explants chorio mimetic substrat hizmet vermektedir immobilize α4β1 Integra üzerinde eki değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu vitro yaklaşım eki ve birden çok allantois explants farklı ardışık zaman noktalarda davranışını yayılan nitel bir değerlendirme sağlar. Protokol hedeflenen fare mutasyonlar, uyuşturucu veya gebelik komplikasyonları veya fetal kayıp allantois eki ex vivoolarak bağlı çeşitli çevresel faktörlerin etkisini araştırmak için kullanılır.

Plasenta embriyonik gelişim ve rahim ortamı için vazgeçilmezdir. Endokrin ve bağışıklık organ oksijen, metaboliti ve maternal ve fetal dolaşım ve ayrıca işlevleri arasında besin alışverişini arabirimdeki oluşturmaktadır. Plasental geliştirme bozar endojen veya eksojen hakaret intrauterin büyüme geriliği, gebelik kaybı veya gebelik komplikasyonları, fareler ve insanlar1yol açabilir. Anormal plasental Fizyoloji neden hedeflenen fare mutasyonlar sayısı ile şu anda fare genom Bilişim (MGI) Web sitesinde listelenen 219 genotip2, artmaya devam ederken (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), bu fenotip....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fare üreme Regierung Unterfranken tarafından kabul edildi ve tüm analizler tüm Alman ve Avrupa Birliği yasalara ve yönetmeliklere bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili sıkı doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.

1. Microtiter kaplama α4β1 Integrin ile Eski Utero Allantois Explant kültür için tabaklar

  1. 200 µg/mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), fare α4β1 liyofilize integrin sulandırmak. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve fare allantoides ex vivoexplant yöntemi açıklanır ve in vivo chorioallantoic füzyon sırasında α4β1 integrin allantois eki, kritik bir süreç değerlendirme nitel ayrıntıları. Şekil 1A-H temsilcisi sonuçlar allantois yalıtım hamile rahim başlayarak birbirini izleyen adımları göstermektedir. Rahim boynuzları, yağ dokusu ve gemiler (?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yanlısı yapıştırıcı hücre dışı matriks moleküllerini fibronektin gibi zengin bir kaynağıdır, serum huzurunda allantois explants kolayca çeşitli plastik, cam veya filtre yüzeyler9,16eklemek olacaktır. Böylece, gerçekleştirilen tahlil amacı özellikle bir genetik değişiklik etkisini araştırmak için veya başka bir tedavi allantois eki için immobilize α4β1 ise, non-spesifik bağlayıcı siteleri (örneğin, sığır serum ile .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (için A.G.) tarafından desteklenmiştir.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J wildtype miceThe Jackson LaboratoryStock No: 000664
70 % (v/v) EthanolVWR International930031006
Standard pattern forcepsFine Science Tools11000-12Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forcepsFine Science Tools11254-20Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. 
Fine scissors Fine Science Tools14094-11Straight blades.
Spring scissors Fine Science Tools15012-12Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
MicrospoonCarl RothAT18.15 mm Spoon diameter.
Microtiter platesibidi81501We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dishNunc150350Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dishNunc150288Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips BiozymVT0140XLow binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrinR&D Systems6054-A4Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma AldrichD8537Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)PAN BiotechP04-03600The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/StreptomycinGibco (ThermoFisher Scientific)15140-122100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-GlutaminePAN BiotechP04-80100100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum BiochromS 0115We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA7030We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-FormaldehydeCarl Roth0335.2To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. 
Triton X-100Sigma AldrichX100Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serumSigma AldrichG9023To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 AntibodiesBD Biosciences550274Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodiesThermo FisherA-11006Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert LeitzLabovert Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.  
M80Leica MicrosystemsM80Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000BLeica MicrosystemsDM4000BMicroscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. 
Digital cameraJVCKY-F75U3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscopeLeica MicrosystemsSP5Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.

  1. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
  2. Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
  3. Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
  4. Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
  5. Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
  6. Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
  7. Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
  8. Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
  9. Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
  10. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
  11. Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
  12. Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
  13. Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
  14. Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
  15. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
  16. Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
  17. Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
  18. Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
  19. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved