Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke

Drosophila æggestokken er en fremragende modelsystem til at undersøge stamceller niche udvikling. Om metoder til dissekere larve og voksen æggestokke er blevet offentliggjort, kræver puppe æggestokken dissektioner forskellige teknikker, der ikke er blevet offentliggjort i detaljer. Her skitsere vi en protokol til dissekere, farvning og montering puppe æggestokke.

I modsætning til voksne Drosophila æggestokke, puppe æggestokkene er relativt vanskeligt at få adgang til og undersøge på grund af deres lille størrelse, translucence og omslutter inden en puppe sagen. Udfordringen at dissekere puppe æggestokkene ligger også i deres fysiske placering i puppe: æggestokkene er omgivet af fedt kroppens celler inde i puppe maven, og disse fedtceller skal fjernes for at give mulighed for korrekt antistoffarvning. For at overvinde disse udfordringer, udnytter denne protokol tilpassede Pasteur pipets hen til uddrag fedt kroppens celler fra puppe maven. Desuden, en chambered daekglas er brugt i stedet for et microcentrifuge rør under farvning processen for at forbedre synligheden af pupper. Men trods disse og andre fordele af de værktøjer, der anvendes i denne protokol, vellykket gennemførelse af disse teknikker kan stadig indebære flere dage i praksis på grund af den lille størrelse af puppe æggestokke. De teknikker, der er skitseret i denne protokol kunne anvendes til tid kursus eksperimenter, hvor æggestokkene er analyseret i forskellige faser af pupal udvikling.

Forskning i stamceller ved hjælp af Drosophila æggestokke har meget udvidet siden den første dokumentation af en stamcelle niche^1,2,3,4. Efter udviklingen af afstamning sporingen genetiske værktøjer, Drosophila æggestokken dissektioner har været almindeligt anvendt til at undersøge stamceller lineages og signalering veje, der regulerer stamcelle vedligeholdelse, spredning og skæbne i stamceller niche. Kendskab til disse signaling veje kan give indsigt i potentielle årsager til kræft, der stammer fra afvigende stamcelle akti....

1. EggLaying

1. Kombinere cirka ti mand og femten kvindelige voksne Drosophila fluer af den ønskede genotype i et hætteglas med normal rige flyve mad suppleret med gær. For at undgå overbefolkning hætteglasset, tillade skytterne hunner til at lægge æg længere end 2-4 h¹⁴.
2. Overføre voksne fra hætteglasset ind i en ny hætteglas ved at trykke på hætteglasset åbning mod en forskellige hætteglas med flyve mad. Tillad æg til at udvikle sig til larver ved stuetem.......

Vellykket gennemførelse af denne procedure bør resultere i klare antistoffarvning, der afslører den struktur og cellulære organisation af en Drosophila puppe æggestokken. Immunhistokemi skitseret i denne protokol kan bruges til at identificere celletyper almindeligt farves i larve og voksen æggestokke. Celler puppe stængelens afledt af swarm celler¹⁸ (beskrevet af Fasciclin III i hvid) er vist i figur 3. Ud over at frem.......

Det mest vigtige og vanskelige skridt af denne protokol omfatter forberedelse af puppe æggestokke før fiksering. For at sikre, at æggestokkene, små og begravet af fedt kroppens celler inde i puppe maven, farves tilstrækkeligt med antistoffer, er det vigtigt at ikke kun rive en stor åbning i den abdominal sæk med pincet, men også ekstrakt fedt kroppens celler, der hæmmer den æggestokkene fra antistoffer. Vellykket gennemførelse af dette trin kræver anvendelsen af subtil pres på Pasteur afpipetteres pære mens.......

Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health (RO1 GM079351 til D.K.). Vi takker Dorothea Godt for hendes nyttige råd om puppe æggestokken dissektioner baseret på hendes oprindelige protokol. Vi takker også Amy Reilein for hendes hjælp og kommentarer til manuskriptet.