Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

Contrairement aux ovaires de drosophile adultes, ovaires nymphales sont relativement difficiles d’accès et examiner en raison de leur petite taille, la translucidité et moulant au sein de la pupe. Le défi de disséquer les ovaires nymphales réside aussi dans leur emplacement physique au sein de la chrysalide : les ovaires sont entourées par des cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, et ces cellules adipeuses doivent être enlevés pour permettre une bonne anticorps. Pour surmonter ces défis, ce protocole utilise des pipettes Pasteur personnalisés afin d’extraire les cellules du tissu adipeux de l’abdomen pupal. En outre, une lamelle compartimentée est utilisée à la place d’un tube de microcentrifuge pendant le processus de coloration pour améliorer la visibilité de la pupe. Cependant, malgré ces et d’autres avantages des outils utilisés dans le présent protocole, l’exécution réussie de ces techniques peut nécessiter encore plusieurs jours de pratique en raison de la petite taille des ovaires nymphales. Les techniques décrites dans le présent protocole pourraient être appliquées à des expériences de cours moment où ovaires sont analysés à différents stades de développement de pupe.

Recherche sur les cellules souches utilisant drosophile ovaires a largement augmenté depuis la première documentation d’une cellule souche niche^1,2,3,4. Suit l’évolution des outils génétiques du traçage de lignage, drosophile ovaire dissections ont été couramment utilisées pour étudier des lignées de cellules souches et les voies qui régulent la maintenance des cellules souches, la prolifération et sort dans la niche de cellules souches de signalisation. Connaissance de ces voies de signalisation peut-être donner un aperçu ....

1. EggLaying

1. Mélanger environ dix hommes et quinze femelles adultes drosophile mouches du génotype désiré dans un flacon de nourriture normale de mouche riche additionné de levure. Pour éviter le surpeuplement de la fiole, permettent des femelles accouplées à pondre pour pas plus de 2 à 4 h¹⁴.
2. Transférer les adultes à partir du flacon dans un flacon de nouveau en tapant sur le flacon d’ouverture contre un flacon différent avec de la nourriture volée. Lai.......

L’exécution réussie de cette procédure devrait se traduire par anticorps clair coloration qui révèle la structure et l’organisation cellulaire d’un ovaire de pupes de drosophile . Immunohistochemistry décrite dans le présent protocole peut être utilisé pour identifier les types de cellule couramment teintés ovaires larvaires et adultes. Les cellules de la tige de pupe dérivé essaim cellules¹⁸ (contour blanc par Fasciclin III) sont indiqu?.......

L’étape la plus critique et difficile du présent protocole nécessite la préparation des pupes ovaires avant la fixation. Pour s’assurer que les ovaires, petits et enterrées par les cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, sont suffisamment colorées avec les anticorps, il est important de larme non seulement une grande ouverture dans le sac abdominale avec une pince, mais aussi extraire les cellules de corps gras qui obstruent les ovaires de l’anticorps. L’exécution réussie de cette ?.......

Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (GM079351 RO1 à D.K.). Nous remercions Dorothea Godt pour ses conseils utiles sur des dissections ovaire pupal basé sur son protocole original. Nous remercions également Amy Reilein pour son aide et les commentaires sur le manuscrit.