Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.

Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische^1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammze....

(1) EggLaying

1. Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h¹⁴.
2. Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein an.......

Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen¹⁸ (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestel.......

Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts .......

Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.