विच्छेदन और Drosophila Pupal अंडाशय के दाग

Published: March 2nd, 2018

DOI:

10.3791/56779

Karen Sophia Park¹, Dorothea Godt², Daniel Kalderon¹

¹Department of Biological Sciences, Columbia University, ²Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Drosophila अंडाशय स्टेम सेल आला विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है । हालांकि लार्वा और वयस्क अंडाशय विदारक के लिए विधियां प्रकाशित किया गया है, pupal अंडाशय विच्छेदन विभिंन तकनीकों है कि विस्तार से प्रकाशित नहीं किया गया है की आवश्यकता है । यहां हम विच्छेदन, धुंधला, और बढ़ते pupal अंडाशय के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा ।

वयस्क Drosophila अंडाशय के विपरीत, pupal अंडाशय का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल है और उनके छोटे आकार, translucence के कारण की जांच, और एक pupal मामले के भीतर डिब्बे । pupal अंडाशय विदारक की चुनौती भी pupa के भीतर अपने भौतिक स्थान में निहित है: अंडाशय pupal पेट के अंदर वसा शरीर की कोशिकाओं से घिरे हुए हैं, और इन वसा कोशिकाओं को उचित एंटीबॉडी धुंधला के लिए अनुमति हटा दिया जाना चाहिए । इन चुनौतियों से उबरने के लिए, इस प्रोटोकॉल pupal पेट से वसा शरीर की कोशिकाओं को निकालने के लिए अनुकूलित पाश्चर pipets का इस्तेमाल करता है । इसके अलावा, एक चैम्बर्ड coverglass धुंधला प्रक्रिया के दौरान एक microcentrifuge ट्यूब के स्थान पर प्यूपा की दृश्यता में सुधार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन और इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरणों के अंय लाभों के बावजूद, इन तकनीकों के सफल निष्पादन अभी भी pupal अंडाशय के छोटे आकार के कारण अभ्यास के कई दिनों में शामिल हो सकता है । इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीक समय पाठ्यक्रम प्रयोगों है जिसमें अंडाशय pupal विकास के विभिंन चरणों में विश्लेषण कर रहे है के लिए लागू किया जा सकता है ।

स्टेम सेल Drosophila अंडाशय का उपयोग अनुसंधान व्यापक रूप से एक स्टेम सेल आला के पहले प्रलेखन के बाद से विस्तार किया गया है¹^,²^,³^,⁴। आनुवंशिक उपकरण पता लगाने वंश के विकास के बाद, Drosophila अंडाशय विच्छेदों सामांयतः स्टेम कोशिका वंश और संकेत रास्ते का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि स्टेम सेल के रखरखाव, प्रसार, और भाग्य स्टेम कोशिका आला में विनियमित । इन संकेतन रास्ते का ज्ञान ंयायपालिका स्टेम सेल गतिविधि⁵^,⁶^,⁷से उत्पंन कि ....

1. EggLaying

लगभग दस पुरुष और पंद्रह महिला वयस्क सामांय अमीर मक्खी खमीर के साथ पूरक भोजन की एक शीशी में वांछित जीनोटाइप की Drosophila मक्खियों का मिश्रण । शीशी भीड़ से बचने के लिए, साथी महिलाओं की अनुमति के लिए .......

इस प्रक्रिया के सफल निष्पादन स्पष्ट एंटीबॉडी धुंधला है कि संरचना और एक Drosophila pupal अंडाशय के सेलुलर संगठन का पता चलता में परिणाम चाहिए । Immunohistochemistry इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित आमतौर पर लार्वा और .......

इस प्रोटोकॉल की सबसे महत्वपूर्ण और कठिन कदम निर्धारण करने से पहले pupal अंडाशय की तैयारी शामिल है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडाशय, छोटे और pupal पेट के अंदर वसा शरीर कोशिकाओं द्वारा दफन, एंटीबॉडी के साथ पर.......

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (RO1 GM079351 to डी.) ने समर्थन दिया था. हम उसके मूल प्रोटोकॉल के आधार पर pupal अंडाशय विच्छेदन पर उसे उपयोगी सलाह के लिए Dorothea Godt धन्यवाद । हम भी उसकी सहायता और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए एमी Reilein धंयवाद ।

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps, biology	Fine Scientific Tools	11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo Fisher Scientific	155383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-10A
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Analysis software	Carl Zeiss	Zen
9 Depression Glass Spot Plates	Pyrex	7220-85
Pasteur pipet	Fisher Scientific	13-678-6B
Pasteur pipet bulb	Various vendors
Bunsen burner	Various vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1	VWR	48366-067
Dapi Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20
Double-sided tape	Scotch
Nutator	Clay Adams
Fine brush #0, #3-#5	Various vendors
Gilson Pipetman Starter Kit	Thomas Scientific	F167300	Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
10x PBS	Ambion	AM9624	Dilute to 1x PBS
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	5000121	Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)	Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)		Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)	Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)		Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vials	Denville Scientific	V9406
Cotton Balls, For Wide Vials	Genesee Scientific	51-102W
Yeast, Bakers Dried Active	MP Biomedicals	101400
Fly food	Produced in laboratory		Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)	Bloomington Drosophila Stock Center

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