Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

A differenza di adulto Drosophila ovaie, pupale ovaie sono relativamente difficili da accedere ed esaminare a causa della loro piccola dimensione, traslucenza e che incassa all'interno di un caso pupal. La sfida di dissezione pupale ovaie si trova anche nella loro posizione fisica all'interno della pupa: le ovaie sono circondate dalle cellule di grasso corporeo all'interno dell'addome pupal, e queste cellule di grasso deve essere rimosso per consentire la macchiatura dell'anticorpo appropriato. Per superare queste sfide, questo protocollo utilizza personalizzate pipette Pasteur per estrarre le cellule del corpo di grasso dall'addome pupal. Inoltre, un coprioggetto chambered viene utilizzato al posto di un tubo del microcentrifuge durante il processo di colorazione per migliorare la visibilità delle pupe. Tuttavia, nonostante questi ed altri vantaggi degli strumenti utilizzati nel presente protocollo, corretta esecuzione di queste tecniche può coinvolgere ancora diversi giorni di pratica a causa delle piccole dimensioni delle ovaie pupale. Le tecniche descritte in questo protocollo potrebbero essere applicate agli esperimenti di corso di tempo in cui le ovaie sono analizzate nelle varie fasi di sviluppo pupa.

Ricerca sulle cellule staminali utilizzando Drosophila ovaie è ampiamente sviluppato dalla prima documentazione di una cellula staminale nicchia^1,2,3,4. Seguendo lo sviluppo di strumenti genetici di lignaggio traccia, ovaio di Drosophila dissezioni sono stati comunemente utilizzate per lo studio di cellule staminali lignaggi e vie che regolano il mantenimento delle cellule staminali, proliferazione e destino nella nicchia delle cellule staminali di segnalazione. Conoscenza di queste vie di segnalazione può produrre intuizio....

1. EggLaying

1. Combinare circa uomo dieci e quindici femmina adulto drosofila mosche del genotipo desiderato in un flaconcino di normali alimenti ricchi di volare, completati con lievito. Per evitare sovraffollamento il flaconcino, consentire le femmine accoppiate a deporre le uova per non più di 2 – 4 h¹⁴.
2. Trasferire gli adulti dal flaconcino in un flacone nuovo toccando il flaconcino di apertura contro una fiala diversa con alimento. Lasciare le uova a sviluppare in.......

Corretta esecuzione di questa procedura dovrebbe provocare macchiatura dell'anticorpo chiaro che rivela la struttura e l'organizzazione cellulare di ovaio pupal di Drosophila . Immunohistochemistry descritte in questo protocollo può essere utilizzato per identificare tipi cellulari comunemente macchiati nelle ovaie larvale e adulte. Cellule del gambo pupal derivato da sciamano cellule¹⁸ (delineato da Fasciclin III in bianco) sono mostrati nella

Il passo più critico e difficile di questo protocollo prevede la preparazione delle ovaie pupale prima della fissazione. Per garantire che le ovaie, piccole e sepolte dalle cellule di grasso corporeo all'interno dell'addome pupal, sono macchiate sufficientemente con gli anticorpi, è importante non solo strappare una grande apertura nel sacco addominale con il forcipe, ma anche estrarre le cellule di grasso corporeo che ostacolano la ovaie dagli anticorpi. Corretta esecuzione di questo passaggio richiede l'applicazione .......

Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (RO1 GM079351 di D.K.). Ringraziamo Dorothea Godt per i suoi consigli utili su dissezioni dell'ovaia pupal basato sul suo protocollo originale. Ringraziamo anche Amy Reilein per la sua assistenza e commenti sul manoscritto.