Disseksjon og flekker av Drosophila Pupal eggstokkene

Drosophila eggstokken er en utmerket modell for studerer stamcelleforskningen nisjeinteresser utvikling. Selv om metoder for dissekere larver og voksne eggstokkene har blitt publisert, krever pupal eggstokk disseksjoner forskjellige teknikker som ikke er publisert i detalj. Her skissere vi en protokoll for dissekere flekker og montering pupal eggstokkene.

I motsetning til voksen Drosophila eggstokkene, pupal eggstokkene er relativt vanskelige tilgang og undersøke på grunn av sin lille størrelse, translucence og encasing innenfor en pupal sak. Utfordringen med å dissekere pupal eggstokkene ligger også i deres fysiske plassering i puppe: eggstokkene er omgitt av fett kroppens celler inne pupal magen, og disse fett celler må fjernes for å gi riktig antistoff flekker. For å overvinne disse utfordringene, benytter denne protokollen tilpasset Pasteur Pipetter for flergangsbruk for å trekke ut fett kroppens celler fra pupal magen. Videre brukes en kamret coverglass i stedet for et microcentrifuge rør under farging prosessen for å forbedre synligheten av pupae. Men til tross for disse og andre fordeler av verktøyene som brukes i denne protokollen, kan vellykket gjennomføring av disse teknikkene fortsatt innebære flere dager praksis på grunn av den lille størrelsen på pupal eggstokkene. Teknikkene i denne protokollen kan brukes til tid kurs eksperimenter som analyseres eggstokkene på ulike stadier av pupal utvikling.

Stilk cellen forskning benytter Drosophila eggstokkene vokst mye siden den første dokumentasjonen av en stilk cellen nisje^1,2,3,4. Følge utviklingen av avstamning genetisk sporingsverktøyene, Drosophila eggstokk disseksjoner har blitt brukt til å studere stamcelleforskningen overleveringslinjer og signalnettverk trasé som regulerer stamcelleforskningen vedlikehold, spredning og skjebne i stamcelleforskningen nisje. Kunnskap om disse signalveier kan gi innsikt i mulige årsaker til kreft fra avvikende stamcelleforskningen akt....

1. EggLaying

1. Kombiner ca ti mann og femten kvinnelige voksen Drosophila flyr av ønsket genotype i ampuller med vanlig rik fly mat supplert med gjær. For å unngå overbefolkning ampullen, tillate parret kvinner å legge egg i mer enn 2-4 h¹⁴.
2. Overføre voksne fra ampullen til en ny medisinglass ved å tappe ampullen åpning mot ulike ampuller med fly mat. Tillate egg å utvikle i larvae ved romtemperatur for 3-4 dager.

2. velge kvinnel.......

Vellykket gjennomføring av denne prosedyren skal resultere i klart antistoff flekker som avslører struktur og mobilnettet organisering av en Drosophila pupal eggstokken. Immunohistochemistry i denne protokollen kan brukes til å identifisere celletyper ofte farget i larver og voksne eggstokkene. Celler med pupal stilken avledet fra sverme celler¹⁸ (uthevet av Fasciclin III i hvitt) er vist i Figur 3. I tillegg til utheving m.......

Det mest viktige og vanskelige trinnet av denne protokollen innebærer utarbeidelsen av pupal eggstokkene før fiksering. For å sikre at eggstokkene, små og begravd fett kroppens celler inne pupal magen, er farget tilstrekkelig med antistoffer, er det viktig å ikke bare rive en stor åpning i abdominal sekk med tang, men også trekke ut fett kroppens celler som hindrer den eggstokkene fra antistoffer. Vellykket gjennomføring av dette trinnet krever anvendelse av subtile press på Pasteur Pipetter pære mens du vasker.......

Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health (RO1 GM079351 til dk). Vi takker Dorothea Godt for hennes nyttige råd på pupal eggstokk disseksjoner basert på hennes opprinnelige protokollen. Vi takker også Amy Reilein for hennes assistanse og kommentarer på manuskriptet.