Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Developmental Biology
Дрозофилы яичника является система отличная модель для изучения развития ниши стволовых клеток. Хотя методы для рассечения личинок и взрослых яичники были опубликованы, куколки завязи Анатомирование требуют разных методов, которые не были опубликованы в деталях. Здесь мы приводим протокол для рассечения, окрашивание и монтаж куколки яичников.
В отличие от взрослых дрозофилы яичников, куколки яичников являются довольно трудно получить доступ и изучения из-за их малого размера, прозрачность и обшивка внутри куколки дело. Задача рассекает куколки яичников также лежит в их физическое местоположение в пределах куколки: яичников окружены жира тела клетки внутри куколки живота, и эти жировые клетки должны быть удалены для надлежащего антитело пятная. Для преодоления этих проблем, этот протокол использует настроенные Пастер пипец извлечь жир тела клетки из куколки живота. Кроме того камерные coverglass используется вместо пробки microcentrifuge во время процесса окрашивания для улучшения видимости куколок. Однако несмотря на эти и другие преимущества инструменты, используемые в настоящем Протоколе, успешное выполнение этих методов по-прежнему может включать несколько дней практики из-за небольшого размера куколки яичников. Методы, изложенные в настоящем Протоколе может применяться к времени курс эксперименты, в которых анализируются яичников на различных стадиях развития куколки.
Исследования стволовых клеток с использованием дрозофилы яичников широко расширилась с момента первого документации3,2,1,ниши стволовых клеток4. После разработки происхождение генетических средств трассировки, дрозофилы яичника, Анатомирование широко использовались для изучения линий стволовых клеток и сигнальные пути, которые регулируют содержание стволовых клеток, распространение и судьба в нише стволовых клеток. Знание этих сигнальных путей может дать понимание потенциальных причин рака, которые исходят из ошибочной ство....
1. типографа
Успешное выполнение этой процедуры должно привести к Пятнать антитела ясно, которая показывает структуру и клеточной организации дрозофилы куколки яичников. Иммуногистохимии, изложенные в настоящем Протоколе может использоваться для идентификации типов клето.......
Наиболее критический и сложный шаг этот протокол включает подготовку куколки яичников до фиксации. Чтобы гарантировать, что яичники, малые и похороненный жира тела клетки внутри куколки живота, являются достаточно витражи с антителами, важно не только сорвать большое отверстие в брюш?.......
Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (RO1 GM079351 по д.к.). Мы благодарим Dorothea Godt за ее полезные советы по куколки завязи Анатомирование, на основе ее первоначального протокола. Мы также благодарим Эми Reilein за ее помощь и комментарии на рукопись.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
Bunsen burner | Various vendors | ||
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Double-sided tape | Scotch | ||
Nutator | Clay Adams | ||
Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved