Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.

A diferencia de ovarios de Drosophila adultos, pupas ovarios son relativamente difíciles de acceder y examinar debido a su pequeño tamaño, transparencia y encerrar dentro de una envoltura pupal. El reto de disección de ovarios pupas también radica en su ubicación física dentro de la pupa: los ovarios están rodeados por las células del cuerpo de la grasa dentro del abdomen pupal, y estas células de grasa debe ser removidas para permitir para la tinción de anticuerpos adecuada. Para superar estos desafíos, este protocolo utiliza pipetas de Pasteur modificado para requisitos particulares para extraer las células de la grasa corporal del abdomen pupal. Por otra parte, un cubreobjetos cámara se utiliza en lugar de un tubo de microcentrífuga durante el proceso de tinción para mejorar la visibilidad de las pupas. Sin embargo, a pesar de estas y otras ventajas de las herramientas utilizadas en el presente Protocolo, ejecución acertada de estas técnicas todavía puede implicar varios días de práctica debido al pequeño tamaño de los ovarios de la pupas. Las técnicas descritas en este protocolo se podrían aplicar a los experimentos de curso de tiempo en el que los ovarios se analizan en diversas etapas de desarrollo pupal.

Investigación de células madre usando Drosophila ovarios ha expandido ampliamente desde la primera documentación de la célula de vástago hueco^1,2,3,4. Tras el desarrollo de herramientas genéticas del seguimiento del linaje, ovario del Drosophila disecciones se han utilizado comúnmente para el estudio de linajes de células madre y señalización vías que regulan el mantenimiento de células madre, proliferación y suerte en el nicho de células madre. Conocimiento de estas vías de señalización puede dar ideas sobre posibles causa....

1. oviposición

1. Combinar unos diez hombres y quince mujeres Drosophila moscas del genotipo deseado en un frasco de alimento mosca rico normal con levadura. Para evitar hacinamiento el frasco, deje que acoplado las hembras a desovar durante no más de 2 – 4 h¹⁴.
2. Transferencia de los adultos del frasco en un frasco nuevo golpeando el frasco apertura contra un frasco diferente con la comida de mosca. Permita que los huevos se convierten en larvas a temperatura ambiente .......

Ejecución exitosa de este procedimiento debe resultar anticuerpos clara coloración que revela la estructura y organización celular de un ovario pupal de Drosophila . Inmunohistoquímica que se describe en este protocolo puede utilizarse para identificar tipos celulares comúnmente teñidos en ovarios de larvarios y adultos. Las células del tallo pupa derivado de enjambre de células¹⁸ (descritas por Fasciclin III en blanco) se muestran en la

El paso más crítico y difícil de este protocolo consiste en la preparación de ovarios pupas antes de la fijación. Para asegurarse de que los ovarios, pequeño y enterrados por las células de grasa corporal dentro de la pupa del abdomen, se tiñen suficientemente con los anticuerpos, es importante no sólo romper una abertura grande en el saco abdominal con pinzas, pero también extraer las células del cuerpo de grasa que obstruyen la ovarios de los anticuerpos. Ejecución exitosa de este paso requiere aplicación .......

Esta investigación fue apoyada por los institutos nacionales de salud (to1 GM079351 a D.K.). Damos las gracias por sus consejos sobre disecciones de ovario pupa basados en su Protocolo original Dorothea Godt. También agradecemos a Amy Reilein por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito.