Dissektion och färgning av Drosophila Pupp äggstockarna

Drosophila äggstocken är en utmärkt modell för att studera stamceller nisch utveckling. Även om metoder för dissekera larver och vuxna äggstockarna har publicerats, kräver Pupp äggstock dissektioner olika tekniker som inte har publicerats i detalj. Här beskriver vi ett protokoll för dissekera, färgning och montering Pupp äggstockarna.

Till skillnad från vuxna Drosophila äggstockar, Pupp äggstockar är relativt svårt att komma åt och undersöka på grund av deras små storlek, genomskinlighet och innesluta inom en Pupp fall. Utmaningen att dissekera Pupp äggstockarna ligger också i deras fysiska plats inom puppan: äggstockarna är omgivna av fett kroppsceller inne i Pupp buken, och dessa fettceller måste avlägsnas för att möjliggöra korrekt antikropp färgning. Detta protokoll använder för att övervinna dessa utmaningar, och tredjeparts anpassade Pasteur-pipetter för att extrahera fett kroppsceller från Pupp buken. Dessutom används ett kamrar täckglas istället för en mikrocentrifug rör under färgning processen för att förbättra synligheten för puppor. Men trots dessa och andra fördelar med de verktyg som används i detta protokoll, kan framgångsrikt genomförande av dessa tekniker fortfarande innebära flera dagars praktik på grund av den lilla storleken på Pupp äggstockarna. De tekniker som beskrivs i detta protokoll skulle kunna tillämpas på tid kursen experiment där äggstockarna analyseras i olika skeden av Pupp utveckling.

Stamcellsforskning använda Drosophila äggstockarna har kraftigt expanderat sedan den första dokumentationen av en stamcell nisch^1,2,3,4. Följer utvecklingen av lineage tracing genetiska verktyg, Drosophila äggstock dissektioner har ofta använts för att studera stamceller härstamningar och signalering vägar som reglerar stamceller underhåll, spridning och öde i stamcellsnischen. Kunskap om dessa signalvägar kan ge insikter om potentiella orsaker till cancer som härrör från aberrant stem cell aktivitet⁵

1. EggLaying

1. Kombinera cirka tio manliga och femton kvinnliga vuxna Drosophila flugor av önskad genotyp i en injektionsflaska av normala rik flyga mat kompletteras med jäst. För att undvika överbeläggning injektionsflaskan, Tillåt Parade honorna att lägga ägg längre än 2-4 h¹⁴.
2. Överför vuxna från injektionsflaskan till en ny injektionsflaska genom att trycka på ampullöppningen mot olika injektionsflaska med flyga mat. Låt äggen utvecklas till larver i .......

Framgångsrikt genomförande av detta förfarande bör resultera i tydlig antikropp färgning som avslöjar struktur och cellulära organisation av en Drosophila Pupp äggstock. Immunohistokemi som beskrivs i detta protokoll kan användas för att identifiera celltyper som ofta färgas i larver och vuxna äggstockarna. Cellerna i Pupp stjälken härrör från swarm celler¹⁸ (beskrivs av Fasciclin III i vitt) visas i figur 3. F.......

Det mest kritiska och svåra steget i detta protokoll innebär utarbetandet av Pupp äggstockarna före fixering. För att säkerställa att äggstockarna, små och begraven av fett kroppsceller inuti Pupp buken, färgas tillräckligt med antikroppar, är det viktigt att inte bara Riva en stor öppning i buken säcken med pincett, men också extrahera fett kroppens celler som hindrar den äggstockarna från antikropparna. Framgångsrikt genomförande av detta steg kräver tillämpning av subtila tryck på Pasteur Pipette.......

Denna forskning stöddes av National Institutes of Health (RO1 GM079351 till D.K.). Vi tackar Dorothea Godt för hennes goda råd om Pupp äggstock dissektioner baserat på hennes ursprungliga protokollet. Vi tackar också Amy Reilein för hennes hjälp och synpunkter på manuskriptet.