JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Developmental Biology

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Published: March 2nd, 2018

DOI:

10.3791/56779

1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Yetişkin Drosophila yumurtalık, Pupa yumurtalık erişmek ve onların küçük nedeniyle incelemek nispeten zor olan boyut, translucence ve bir pupa dava içinde kapatan. Pupa yumurtalık dissekan meydan aynı zamanda fiziksel konumlarını pupa içinde yatıyor: yumurtalık içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından çevrilidir ve bu yağ hücrelerinin doğru antikor boyama için izin vermek için kaldırılması gerekir. Bu zorlukları aşmak için pupa karından yağ vücut hücreleri ayıklamak için özelleştirilmiş Pasteur pipets bu protokolü kullanır. Ayrıca, Pupa görünürlüğünü artırmak için odacıklı bir coverglass yerine microcentrifuge tüp boyama işlemi sırasında kullanılır. Ancak, bu ve diğer avantajları bu protokol için kullanılan araçlar rağmen bu tekniklerin başarılı yürütme hala pratik pupa yumurtalık küçük boyutu nedeniyle birkaç gün içerebilir. Bu protokol için özetlenen teknikleri yumurtalık çeşitli yaşlardaki pupa analiz edilir zaman ders deneyler için uygulanabilir.

Drosophila yumurtalık kullanarak kök hücre araştırma kök hücre niş1,2,3,4ilk belgelenmesi beri yaygın olarak genişletti. Soy izleme genetik araçlarını, Drosophila yumurtalık diseksiyonlarının sık kök hücre soy eğitim için kullanılan gelişimi takip ve kök hücre bakım, yayılmasını önleme ve kök hücre niş kadere düzenleyen yolları sinyal. Bu sinyal yolları bilgisine kanserlerin anormal kök hücre etkinlik5,6,7' den kaynaklanan olası ne....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. EggLaying

  1. Yaklaşık on erkek ve on beş kadın yetişkin Drosophila sinekler istenen genotip normal zengin sinek yemek Maya ile desteklenmiş bir şişe içinde birleştirir. Şişeyi aşırı kalabalık önlemek için 2-4 h14saatten uzun için yumurtlamak şeklindeki kadın izin.
  2. Yetişkinler şişeyi uçmak gıda ile farklı bir şişe karşı açılış şişe dokunarak yeni bir şişe aktarın. Larvalar, oda sıcaklığında içine 3-4 gün için geliştirmek y.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yordamın başarılı yürütme Drosophila pupa yumurtalık hücresel organizasyonu ve yapısını ortaya açık antikor boyama sonuçlanmalıdır. Bu protokol için özetlenen immünhistokimya genellikle larva ve yetişkin yumurtalıklarda lekeli hücre tipleri tanımlamak için kullanılabilir. Türetilen pupa SAP hücrelerinin hücre (beyaz Fasciclin III tarafından özetlenen)18 şekil 3' te gösterilen sürüsü. Pupa .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralının en kritik ve zor adım pupa yumurtalık fiksasyon öncesinde hazırlanması içerir. Yumurtalıklar, küçük ve gömülü içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından yeterince antikorlar ile lekeli emin olmak için sadece büyük bir açılış karın yatakta Forseps ile gözyaşı ama aynı zamanda engel yağ vücut hücreleri ayıklamak önemlidir Yumurtalık antikorlar üzerinden. Bu adımın başarılı yürütme gerektirir yağ vücut hücrelerinin karın çuval dışarı yıkama.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (RO1 GM079351 D.K. için). Dorothea Godt onun orijinal protokolüne dayanan pupa yumurtalık diseksiyonu yararlı onun tavsiye için teşekkür ediyoruz. Biz ayrıca Amy Reilein ona yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Dumont #5 Forceps, biologyFine Scientific Tools11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered CoverglassThermo Fisher Scientific155383
Dissection microscopeNikonSMZ-10A
Confocal MicroscopeCarl ZeissLSM 700
Analysis softwareCarl ZeissZen
9 Depression Glass Spot PlatesPyrex7220-85
Pasteur pipetFisher Scientific13-678-6B
Pasteur pipet bulbVarious vendors
Bunsen burnerVarious vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope SlidesThermo Fisher Scientific12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1VWR48366-067
Dapi Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Double-sided tapeScotch
NutatorClay Adams
Fine brush #0, #3-#5Various vendors
Gilson Pipetman Starter KitThomas ScientificF167300Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
10x PBSAmbionAM9624Dilute to 1x PBS
Normal Goat SerumJackson ImmunoResearch5000121Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vialsDenville ScientificV9406
Cotton Balls, For Wide VialsGenesee Scientific51-102W
Yeast, Bakers Dried ActiveMP Biomedicals101400
Fly foodProduced in laboratoryMixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)Bloomington Drosophila Stock Center

  1. Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
  2. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
  3. Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
  4. Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
  5. Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
  6. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  7. Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
  8. Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
  9. Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
  10. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
  11. King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
  12. Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
  13. Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
  14. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
  15. Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
  16. Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
  17. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  18. Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
  19. Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
  20. Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
  21. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved