بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة

Summary

ويقدم بروتوكول لاستخلاص نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة تربة واحدة في وقت واحد، مما يسمح عينة انخفاض إعداد مرات وتمكين متعدد omic الكتلي تحاليل العينات بكميات محدودة.

Abstract

الطيف الكتلي (مللي ثانية)-ميتابروتيوميك متكامل يستند إلى، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك (multi-أوميك) في تحويل قدرتنا على فهم وتميز المجتمعات الميكروبية في النظم البيئية والبيولوجية. هذه القياسات حتى تمكن التحليلات المعززة للمجتمعات الميكروبية التربة المعقدة، التي أكثر النظم الميكروبية المعقدة المعروفة حتى الآن. تحليلات متعددة-أوميك، ومع ذلك، قد التحديات إعداد عينة، منذ عمليات الاستخراج منفصلة مطلوبة عادة لكل دراسة أوميك، إلى حد كبير وبالتالي تضخيم إعداد الوقت وكمية العينة المطلوبة. لمعالجة هذا القيد، تم إنشاء أسلوب 3 في 1 لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (مبليكس) من نفس العينة التربة بتكييف نهج قائم على أساس مذيب. أثبت هذا البروتوكول مبليكس على حد سواء بسيطة وقوية للعديد من أنواع العينات، حتى عندما تستخدم لكميات محدودة من عينات التربة المعقدة. الأسلوب مبليكس كبير أيضا تمكين القياسات المتعددة-أوميك السريع اللازم للحصول على فهم أفضل لأعضاء كل جماعة الميكروبية، أثناء تقييم التغيرات التي تحدث عند الاضطرابات البيولوجية والبيئية.

Introduction

تقييم المجتمعات الميكروبية في التربة آثار هامة لفهم الكربون ركوب الدراجات، وتغير المناخ. قد أبرزت الدراسات الأخيرة لكن الصعوبات، مثل عدم وجود تسلسل الجينوم الحجمية في مختلف أنواع التربة والدالة غير معروف للعديد من البروتينات الكشف عن. هذه نتيجة التحديات نظراً للتربة يجري المجتمع الميكروبي أعقد المعروفة حتى الآن^1،،من²³. تحليلات متعددة-أوميك، التي تجمع بين النتائج من الجينومية، ميتاترانسكريبتوميك، ميتابروتيوميك، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك، قد نفذت مؤخرا في العديد من الدراسات التربة على اكتساب فهم أكبر في الميكروبات الحالية، بينما الحصول على معلومات شاملة حول التغيرات الجزيئية التي تحدث بسبب الاضطرابات البيئية^1،،من⁴⁵. التحدي واحدة مع دراسات متعددة-أوميك هو أن الكتلي (مللي ثانية)-استناداً إلى قياسات ميتابروتيوميك، metabolomic، ليبيدوميك، وعادة ما تتطلب عملية استخراج محددة لكل أوميك أن يكون مرض التصلب العصبي المتعدد متوافق مع^{6،7 , 8 , 9}-هذه الإجراءات الدقيقة جعل تنفيذها صعباً أو مستحيلاً للغاية عندما فقط تتوفر كمية محدودة من عينة. هذه التحديات قد حدا بنا إلى التحقيق في أسلوب متزامنة من استخراج (مبليكس) المستقلب والبروتين والدهن قادرة على استخدام أصغر حجم العينة أو الجماهير، وتحسين دقة وتوفير الاستعدادات عينة أسرع لجميع التحاليل الثلاثة ¹⁰-حتى الآن، لا توجد أي إجراءات استخراج التربة البديلة التي يمكن تحقيق كل هذه الأهداف.

لتمكين تحليلات عالمية متعددة-أوميك من عينة التربة واحدة، كان بروتوكولا استخلاص بالمذيبات عضوية استناداً إلى كلوروفورم، والميثانول، وفصل المياه المستخدمة¹⁰. هذا الأسلوب وضعت أصلاً للدهن مجموع الاستخراج^9،11 ، وفي الآونة الأخيرة عدل لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة واحدة^{12،13 ،14،15،16،17،،}من^1819،،من^{2021،22، 23،24،25،26،27،28،،}من²⁹³⁰، تمكين أقل كمية العينة و ¹⁰من تقلب التجريبية. في بروتوكول مبليكس، كلوروفورم ليس الامتزاج مع الماء، مما يوفر الأساس لفصل مكونات عينة ثلاثية الأطوار الكيميائية إلى كسور متميزة. ولذلك تتضمن المرحلة مائي أعلى والايضات ماء، متبوعة بقرص بروتين، ومن ثم طبقة الدهون في مرحلة كلوروفورم السفلي (الشكل 1). عندما يتم تطبيق مبليكس على معظم أنواع التربة، جسيمات الحطام يتراكم في الجزء السفلي من أنابيب أخذ العينات ويمكن التخلص منها بعد أن يتم جمع كل الطبقات. كل نوع من أنواع التربة يمكن أن تكون مختلفة، ومع ذلك، وفي التربة العضوية العالية مثل الخث، والحطام التربة يبقى في الطبقة الوسطى، ولا تقع على الجزء السفلي من أنبوب أخذ العينات. مبليكس يوفر العديد من المزايا عند عزل جزيء عدة أنواع من نفس العينة مثل كميات 1) أصغر بعينه يمكن أن تستخدم لتحليلات متعددة-أوميك، 2) multi-omic الاستخراج من النقصان عينة نفس تقلب التجريبية عموما، و 3) يمكن إعداد أسرع بكثير عدد أكبر من العينات ل دراسات الإنتاجية أعلى¹⁰. معا هذه الفوائد أمر حيوي لتوفير قدرات القياس بشكل أفضل لتقييم عينات التربة ومجتمعاتهم الجرثومية المعقدة.

Protocol

ملاحظة: يمكن ليوفيليزيد التربة رطبة جداً قبل استخراج دون الأضرار بالفعالية للاستخراج. يمكن أيضا استخدام التربة الرطبة لكن ينبغي النظر عند إضافة الكواشف في نسب محددة.

ملاحظة: من المستحسن استخدام 20 غراما وزن التربة الجافة للاستخراج، التي يجب تقسيمها بين أنبوبين 50 مل (بحد أقصى 10 جرام التربة في أنبوب 50 مل). يمكن تحجيم عمليات الاستخراج صعودا أو هبوطاً يعتمد على العينة المتاحة.

ملاحظة: يمكن غربلة عينات التربة الجافة من خلال شاشة 3 مم لمجانسة وإزالة الجذور الصغيرة والصخور. لا منخل عينات التربة الرطبة، كما سوف تتعثر العينة في الشاشة.

1-التربة تحلل الخلية واستخراج من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (توقيت د ~ 1)

1. كل عينة التربة ز 20، تزن 10 جرام إلى أنبوبين منفصلين 50 مل الميثانول/كلوروفورم متوافقة. تكون حذراً للغاية مع أنابيب المختار، كما سوف ليتش كلوروفورم معظم المواد البلاستيكية، تلوث العينات. استخدام الزجاج كلما كان ذلك ممكناً أو البلاستيكية أنابيب مصنوعة من بولي بروبلين أو تترافلوروايثيلين (PTFE).
   ملاحظة: الحفاظ على التربة على الجليد وباردة قدر الإمكان خلال الخطوات الأولية وزنها والتجانس.
2. إضافة 10 مل كلوروفورم غسلها الفولاذ المقاوم للصدأ وحبات العقيق لكل أنبوبة. على الجليد، إضافة 4 مل البرد عالي النقاوة الماء (انظر الجدول للمواد لنظام تنقية) لكل أنبوبة (تقسيم عينة واحدة بين أنبوبين) ونقل العينات دلو الجليد في غطاء دخان.
3. بسرعة باستخدام ماصة مصلية زجاج 25 مل، إضافة 20 مل من المثلج 2:1 كلوروفورم: الميثانول (v/v).
   تنبيه: لقد كلوروفورم: الميثانول حدة الآثار الصحية المحتملة: الجلد تهيج والحروق الكيميائية المحتملة، وتهيّج الجهاز التنفسي. قد يؤثر على الكلي والكبد والقلب. ارتداء نظارات واقية مناسبة وملابس، والقفازات، والعمل دائماً في غطاء دخان.
4. تشديد على أغطية ودوامه في الحل. choloroform:methanol 2:1 يساعد على كسر جدار خلية بدائيات النوى ويحللها أيضا الأنشطة الانزيمية.
5. إرفاق هذه الأنابيب إلى 50 مل أنبوبة الدوامة المرفقات ودوامه لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية داخل ثلاجة أفقياً إذا أمكن. ثم وضع العينات داخل ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة دقيقة ~ 15 بغية تهدئة لهم تماما.
6. استخدام سونيكاتور تحقيق داخل غطاء دخان، sonicate كل عينة مع تحقيق 6 مم (1/4 ") في السعة 60% لمدة 30 ثانية كل على الجليد.
   تنبيه: يوصي باستخدام صوت تخف حماية الضميمة والإذن أثناء سونيكاتينج. الجهد العالي موجود في كابل العرض والترددات العالية الطاقة. تجنب لمس الجانبين السفينة عينة أو السفلي مع فحص نشط؛ قد صدع أو ذوبان البلاستيك.
7. وضع العينات في الثلاجة-80 درجة مئوية ~ 15 دقيقة، كما سونيكاتينج يمكن أن تولد الكثير من الحرارة.
8. كرر الخطوات من 1، 1، 5-7.
   ملاحظة: تأكد من البقاء باردة طوال فترة الإجراءات تحلل العينات.
9. الطرد المركزي هذه العينات في س 4,000 ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. عند هذه النقطة، سيتم فصل العينة إلى الطبقة العليا المستقلب إينتيرلايير البروتين، وانخفاض طبقة الدهن (وبيليه الحطام المتبقي). انظر الشكل 1.
10. وضع العينات على الجليد دلو الجليد، وداخل غطاء دخان واستخدام 10 مل زجاج ماصة مصلية، إزالة الطبقات العليا المستقلب من أنبوبين 50 مل في قنينة زجاجية كبيرة واحدة.
    ملاحظة: تجنب يسفط أي طبقة البروتين إلى الماصة؛ ترك طبقة صغيرة من المستقلب إذا لزم الأمر.
11. إمالة أنبوب 50 مل بالإفراج عن إينتيرلايير البروتين حيث يكون العائمة مجاناً عند طبقة الدهن أقل قليلاً. باستخدام ملعقة مسطحة رئيس مختبر فولاذ المقاوم للصدأ نظيفة، حلج القطن كلا من إينتيرلاييرس البروتين بعناية ووضعها معا في أنبوب 50 مل واحد جديد.
12. استخدام ماصة مصلية زجاج 25 مل، إزالة طبقات الدهون أقل في قنينة زجاجية كبيرة واحدة.
    ملاحظة: في محاولة لتجنب تطمح جزيئات التربة؛ ومع ذلك، تطمح بعض التربة الحطام والجزيئات جنبا إلى جنب مع الدهون سيتم إزالة في وقت لاحق.
13. مكان تنفس الأغشية عبر الجزء العلوي من المستقلب والدهن زجاج قارورة وجاف في مركز فراغ حتى جفاف (الدهون ح ~ 4-5، والايضات بين عشية وضحاها).
14. لأنبوب عينة البروتين وأنابيب بيليه الحطام المتبقي، بإضافة 20 مل من الميثانول المثلج لكل منهما ودوامه. ويتم ذلك بالكريات الحطام شطف كلوروفورم قبل محاولة لجعل أي البروتين المتبقية الممكنة من تحت الأنقاض قبل ينثر.
15. أجهزة الطرد المركزي الكريات الحطام والبروتين المدى في 4,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، ثم صب الميثانول في حاوية نفايات الخطرة داخل غطاء دخان.
16. تجميد الكريات البروتين والحطام في النتروجين السائل والجاف في ليوفيليزير (مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية بسبب الميثانول بعد نقطة تجميد منخفضة جداً من-98 درجة مئوية) لمدة ساعة ~ 2.
    ملاحظة: لا جاف الإفراط الكريات، كما أنها ستكون أكثر صعوبة جعل.
17. إضافة 10 مل من البروتين المخزن المؤقت سولوبيليزيشن (الحزب الديمقراطي الصربي 4 ٪، 100 مم DTT (DL-ديثيوثريتول) في 50 ملم تريس العازلة، pH 8.0؛ انظر التكميلية كاشف الإعداد) إلى أنبوب البينية البروتين و 20 مل لكل من الكريات الحطام.
    تنبيه: الحزب الديمقراطي الصربي يسبب السمية الحادة والقابلة للاشتعال. من الجلد والعيون، ومجرى الهواء مهيجة. ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
18. في غطاء الدخان، sonicate المسبار العينات في السعة 20% لمدة 30 ق لتقديمهم إلى الحل. دوامة لمدة 2 دقيقة.
19. ضع العينة البينية البروتين في المدورة أنبوب مختبر مدة 30 دقيقة 300 لفة في الدقيقة، 50 درجة مئوية، جعل البروتين.
20. أفقياً دوامة العينات الحطام 10 دقيقة إضافية أي الخلايا المتبقية سليمة، ثم تدوير مع عينات البروتين البينية ل 20 دقيقة المتبقية.
21. الطرد المركزي جميع العينات في س 4,500 ز لمدة 10 دقائق، درجة حرارة الغرفة (RT)، وجمع المادة طافية من كل أنبوبة كل عينة إلى أنبوبين 50 مل.
22. قم بإضافة 10 مل solubilization المخزن المؤقت للبروتين بيليه البينية، ثم sonicate ودوامه بالعودة إلى الحل وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.
23. دمج في supernatants اثنان أنابيب 50 مل على قدم المساواة والطرد المركزي في 8,000 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية، في دوار دلو زاوية ثابتة.
    ملاحظة: الطرد المركزي نهائي ضروري لإزالة المواد الدبالية تلويث المفرط.
24. صب في supernatants في أنبوبين 50 مل حيث أن هناك 30 مل في كل منهما. ثم، باستخدام 10 مل زجاج ماصة مصلية، إضافة 7.5 مل من كلورفورم الميثيل (حمض التريكلوروسيتيك) لكل أنبوبة. دوامة في الحل. وهذا يجعل نسبة 20% TCA في كل عينة 30 مل (ضبط تبعاً لذلك)،
    تنبيه: TCA هو الكاوية والسامة ومايو تسبب حروق الجلد. ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
25. وضع العينات في ثلاجة-20 درجة مئوية ل 2 (ح) بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: البروتينات سوف يعجل عادة ضمن ح 1، لكن يمكن أن يكون بين عشية وضحاها اليسار (ما يصل إلى 18 س).
    ملاحظة: لا تدع استخراج TCA الذهاب أطول من ح 18 بسبب التحلل حمض ممكن من البروتين. إذا كان يتم تجميد العينة، الذوبان في الجليد؛ لا تدع العينة الاحماء في الماضي ذوبان الجليد.
26. بيليه البروتين سرع، الطرد المركزي العينة في 4,500 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية، وصب المادة طافية في النفايات.
27. إضافة 10 مل الأسيتون المثلج 100% لكل بروتين بيليه، ودوامه، والجمع بين مثل الكريات في أنبوب واحد.
28. الطرد المركزي الأنبوبة المحتوية على بيليه مجتمعة (باستخدام توازن)، ومن ثم صب المادة طافية في النفايات.
    تنبيه: الأسيتون قد يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي، وهو سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء قفازات سلامة النظارات ومعطف معمل، والعمل في غطاء دخان.
29. أغسل بيليه مرتين باستخدام 1.5 مل من الأسيتون ونقل أخيرا إلى أنبوب 2 مل للدوران النهائية في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
30. صب المادة طافية في النفايات وتسمح بيليه لتجف مقلوب على مسح ورقة في غطاء دخان ~ 20 دقيقة أو ضمن إطار دفق نيتروجين حتى تبدأ بيليه قليلاً للقضاء.
31. إضافة 100-200 ميليلتر من المخزن المؤقت سولوبيليزيشن البروتين، تبعاً لحجم بيليه.
    ملاحظة: الاحتفاظ بحجم المخزن المؤقت سولوبيليزيشن إضافة إلى عينة منخفضة قدر الإمكان. يمكن فقط استخدام اللاحقة تصفية مساعدة نموذج إعداد (FASP) ما يصل إلى 50 ميكروليتر من عينة solubilized كل عمود؛ أي يجب أن يكون أكثر انقسام إلى أعمدة فاسب متعددة.
32. Sonicate ودوامه بيليه في الحل. علما بأن العينة قد تكون اللزوجة بسبب المواد الدبالية عجل جنبا إلى جنب مع البروتين، التي سيتم إزالتها مع الطرد المركزي لاحقة.
33. هزة العينة في حاضنة/شاكر مدة 30 دقيقة 300 لفة في الدقيقة، 40 درجة مئوية، جعل البروتين في الحل، والمضي قدما لهضم البروتين.
34. الأداة الإضافية تجميد العينة في النتروجين السائل ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى على استعداد لهضم البروتين.

2-المادة الدهنية إعداد (توقيت ~ 20 دقيقة)

1. وبمجرد عينات الدهن الجاف، إضافة 200 ميكروليتر من 2:1 كلوروفورم: الميثانول إلى القنينة، دوامة في الحل ونقل إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل، إضافة ميكروليتر 200 إضافية للزجاج فيال، دوامة و "الماصة؛" الدهون المتبقية ونقل إلى الأنبوب.
2. الطرد المركزي بين الأنقاض من العينة في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. نقل المادة طافية في قنينة الدهن الزجاج ومخزن في-20 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS/MS (تفاصيل إضافية ل LC-MS/MS في أساليب تكميلية).
4. إذا لا يمكن تحليل العينات مباشرة بعد التحضير، الدهون تحتاج إلى تخزين في المذيبات في-20 درجة مئوية لمنع الأكسدة والتدهور.

3-المستقلب إعداد و Derivatization (توقيت ح ~ 5)

1. في اليوم التالي لاستخراج، إزالة عينات المستقلب من "بطالة سرعة" وتخزين جافة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة ل derivatization والتحليل في GC. إذا لم يكن قيد التشغيل والايضات على نشرة مصورة عمومية، ثم إعداد عليها باستخدام البروتوكول المناسب لهذا الصك.
2. مباشرة قبل ديريفاتيزينج الأيض للتحليل في GC، نقلها من القنينات الزجاجية الكبيرة بإضافة 200 ميكروليتر من الميثانول، فورتيكسينج، وإضافة إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل. كرر مرة واحدة.
3. الطرد المركزي الأنبوب في 12,000 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية في قنينات زجاجية أصغر، إضافة غشاء تنفس إلى الأعلى، ويجف تماما في "بطالة" سرعة.
4. ديريفاتيزي نواتج الأيض بإضافة 20 ميليلتر لحل ميثوكسياميني بعينه القنينة ودوامه لمدة 30 ثانية على فورتيكسير سرعة متوسطة.
   تنبيه: هيدروكلوريد ميثوكسياميني يسبب حروق خطيرة وأضرار خطيرة بالعيون، وقد تسبب حساسية بتماس الجلد. ارتداء نظارات السلامة وقفازات ومعطف المعمل، والعمل في غطاء دخان.
5. استخدام سونيكاتور حمام لضمان حل العينة هو تماما.
6. احتضان العينة في حاضنة مع غطاء منع تكثيف الحفاظ على 37 درجة مئوية عن 1 ساعة و 30 دقيقة مع لفة في الدقيقة 1,000 تهتز.
7. عكس القنينة مرة واحدة لخلط العينات مع قطرات مركزة على سطح الغطاء. تدور العينة إلى أسفل في 1,000 غ س ل 1 دقيقة، الرايت
8. أداء silylation بإضافة 80 ميليلتر (باستخدام المحاقن) ن-الميثيل-N-(تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي مع تريميثيلتشلوروسيلاني 1%. دوامة ل 10s.
   تنبيه: مستفا + 1% فصليا يمكن أن يسبب تآكل الجلد وتلف العين الشديد السمية الشاملة لأعضاء مستهدفة محددة، وهو سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء نظارات السلامة وقفازات ومعطف المعمل، والعمل في غطاء دخان.
9. احتضان العينة في حاضنة مع غطاء منع تكثيف الحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع لفة في الدقيقة 1,000 تهتز.
10. عكس القنينة مرة واحدة لخلط العينات مع قطرات مركزة على سطح الغطاء.
11. تدور العينة إلى الأسفل لمدة 5 دقائق في 2,000 س ز، الرايت
12. نقل الحل رياكتيد في قارورة المناسبة لتحليل GC-MS.

4-البروتين الهضم (توقيت د ~ 1)

1. الطرد المركزي العينة في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق، الرايت، بيليه أي حطام.
2. إجراء تصفية--ساعدت عينة-إعداد (FASP) لهضم فاسب باستخدام مجموعات (انظر الجدول للمواد) بعد تعديل تعليمات الشركة المصنعة^31،32:
   1. إضافة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا المخزن المؤقت إلى عمود فاسب (500 ميكروليتر 30 ك موكو تدور التصفية).
   2. وبمجرد الانتهاء من العينة سينتريفوجينج، "الماصة؛" إيقاف المادة طافية (تجاهل بيليه) وإضافة تصل إلى 50 ميكروليتر من العينة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا في العمود.
      ملاحظة: إضافة فقط يصل إلى 50 ميكروليتر من عينة كل عمود. إذا كان هناك أكثر من 50 ميكروليتر من عينة، استخدام أعمدة متعددة وتجمع بين الببتيدات بعد الهضم. فمن الأفضل أن تترك هذا الحجم منخفضة قدر الإمكان (30 ميليلتر مثالي) بغية ضمان FASP عمود سيؤدي إلى إزالة كل من الحزب الديمقراطي الصربي الذي هائلة يمكن أن تتداخل مع التحليل الشامل المواصفات.
   3. مكان العمود في أنبوب شملت 1.5 مل والطرد المركزي العينة في 14,000 ز خ ل 30 دقيقة، الرايت
   4. إزالة التدفق عبر في النفايات وإضافة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا إلى العمود والطرد المركزي مرة أخرى.
   5. كرر الخطوة السابقة مرة أخرى ليصبح مجموع 3 اليوريا يشطف.
      ملاحظة: تأكد من العينة يذهب ما يقرب من جفاف في العمود، إذا كان هناك أي أكثر من ~ 30 ميليلتر المتبقية على التصفية بعد كل دورة، مواصلة سينتريفوجينج.
   6. إضافة ميكروليتر 400 50 مم NH₄HCO₃ وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 ز س لمدة 20 دقيقة، وتجاهل النفايات وكرر مرة واحدة.
   7. نقل الأعمدة إلى أنبوب الطرد مركزي نظيفة 1.5 مل.
   8. إضافة ميكروليتر 75 التربسين هضم المخزن المؤقت إلى الأعمدة واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3 في حاضنة مع غطاء منع تكثيف في 750 دورة في الدقيقة.
   9. إضافة ميليلتر 40 50 مم NH₄HCO₃ إلى الأعمدة.
   10. الطرد المركزي العينة في س 14,000 ز لمدة 15 دقيقة لجمع الببتيدات في الأنبوب مع الحفاظ على ملوثات عالية الوزن الجزيئي على رأس العمود.
   11. إضافة 40 ميكروليتر من 50 مم NH₄HCO₃ إلى العمود والطرد المركزي مرة أخرى.
3. تجاهل العمود, الجاف أسفل الببتيدات في الأنبوب في "بطالة" سرعة ~ 30 ميليلتر، واتفاق التعاون الأساسي المقايسة (طقم مقايسة البروتين حمض بيسينتشونينيك؛ انظر الجدول للمواد) الببتيدات.
4. بشكل اختياري، أداء خطوة التنظيف في حالة الاشتباه في تلوث مخزونات النشر الاستراتيجي (فقاعات مرئية)³³. ويجب أن يتم استخراج مرحلة صلبة بعد ذلك في حالة اختيار هذا الخيار. تتوفر معلومات مفصلة حول هذا الأسلوب تنظيف في أساليب تكميلية.
5. تخفيف العينة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد أو المضي قدما بشكل اختياري إلى تجزئة [هبلك] (الخطوتين التاليتين).
6. أن يجزئ، تخفف من العينات إلى حجم 400 ميليلتر مع المخزن المؤقت فورمات الأمونيوم 10 ملم (pH 10.0).
7. حل على عمود C18 (انظر الجدول للمواد) بفصل في 0.5 مل/دقيقة باستخدام نظام [هبلك] مع مراحل المتنقلة (A) 10 ملم فورمات الأمونيوم، pH 10.0 و (ب) 10 مم فورمات الأمونيوم، pH 10.0/الاسيتو الانيتريل (10:90).
   1. ضبط التدرج من نسبة 100% A إلى 95% A خلال أول 10 دقيقة، 95% A إلى 65% A خلال دقيقة 10 إلى 70، أ 65% إلى 30% على مدى دقيقة 70 إلى 85، الحفاظ على الأقل 30% A خلال دقيقة 85 إلى 95.
   2. إعادة توازن مع 100% A خلال دقيقة 95 إلى 105 بنسبة 100% A حتى 120 دقيقة.
   3. جمع الكسور كل دقيقة 1.25 (96 الكسور عبر التدرج الكامل) وأخيراً الجمع بين كل صف لما مجموعة 12 عينات أو كل صف آخر للعينات 24 (كل منها n = 8 أو n = 4 الكسور المجمعة).
8. الجاف لجميع الكسور تحت الفراغ وإضافة 15 ميليلتر من الماء عالي النقاوة لكل مخزن في-20 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS/MS.

النتائج

عندما تستخدم بروتوكول مبليكس لاستخراج جزيئات من كانساس البراري الأصلي التربة (تربة موليسول)، قدمت تحليلات ثلاث نتائج الببتيدات 3376 والدهون 105 والايضات القطبية 102 (كل هوية فريدة من نوعها). في حين كان البروتوكول مبليكس راسخة لاستخراج عامة من الدهون ونواتج الأيض¹²

Discussion

من المهم أن نلاحظ أن ليس جميع المختبرات سوف يكون نفس المعدات المتاحة حتى يمكن تكييف أساليب معينة، وعلى سبيل المثال فإن الخطوة تحلل،. هنا نستخدم فورتيكسينج وسونيكاتينج، أن استخدام الخافق حبة كبيرة 50 مل العمل. إذا لم يتوفر ليوفيليزير مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية، ثم يمكن أن تجفف ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498	Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Purified water from Millipore	Milli-Q		Water purification system.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L6026	!Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.
Soil protein extraction kit	MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen	30000-20
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T0699	!Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.
Urea	Sigma-Aldrich	208884	!Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses
Ammonium bicarbonate	Fluka	09830
Trypsin	Promega	V528A	20µg vials
Bicinchoninic acid protein assay kit	Pierce	23227
Ammonium Formate	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998	!Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	!Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904	!Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	!Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane	Sigma-Aldrich	69478	!Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q water purification system	Millipore		model MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Probe sonicator	FisherBrand		model FB505
Refrigerated centrifuge	Eppendorf		model 5810R
50mL tube swinging bucket rotor	Eppendorf	A-4-44
50mL fixed angle rotor	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		model V22PWE150IT
Serological pipette controller	Eppendorf	12-654-100
10mL, 25mL glass serological pipettes	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer with Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads	NextAdvance	SSB14B
0.15 mm garnet beads	MoBio	13122-500
Magnetic stir plate	FisherBrand	11-100-16SH
Magnetic stir bar	FisherBrand	14512130
pH paper strips, pH range 0–14	FisherBrand	M95903
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube	Genesee Scientific	21-103 21-108	chloroform compatible
50mL vortex attachment	MoBio	13000-V1-50
Ice bucket	FisherBrand	02-591-44
27.25x70mm glass vials	FisherBrand	03-339-22K
Breathe Easier plate membranes	Midwest Scientific	BERM-2000
Alcohol wipes	Diversified Biotech	BPWP-1000
Heater shaker incubator	Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analog rotisserie tube rotator	SoCal BioMed, LLC	82422001
Filter-Aided-Sample-Prep kit	FASP; Expedeon	44250
Microplate reader	Biotek, EPOCH
-20 Degree Celsius Freezer	Fisher	13986149
-80 Degree Celsius Freezer	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive ion trap mass spectrometer	Thermo Scientific
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC system	Millford, MA
250mL media bottle	FisherBrand	1395-250
Waters vial	Waters	186002805
Glass MS sample vial and inserts	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC vial and snap caps	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-well plate	Agilent	5042-6454
Large glass vial 27.25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Lyophilizer	Labconco	7934021
Polished stainless steel flat head spatula	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Kim wipes	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column	Waters	186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC system	Agilent Technologies	G1380-90000
1.7mL centrifuge tube	Sorenson	11700
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pasteur Pipettes	FisherBrand	13-678-20A
Pasteur Pipette Bulbs	Sigma-Aldrich	Z111597
Bath Sonicator	Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
Vacuum Centrifuge	Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
MicroSpin Columns, C18 Silica	The Nest Group	SEM SS18V