Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

Riepilogo

Un protocollo è presentato per estrazione di metaboliti, proteine e lipidi da un campione di terreno singolo simultaneamente, permettendo tempi di preparazione del campione ridotto e abilitazione multi-omic analisi di spettrometria di massa di campioni con quantità limitate.

Abstract

Spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic integrato, metabolomica e studi lipidomica (multi-omic) stanno trasformando la nostra capacità di comprendere e caratterizzare le comunità microbiche in sistemi ambientali e biologici. Queste misurazioni sono anche attivazione avanzate analisi delle comunità microbiche complesse del suolo, che sono i più complessi sistemi microbici noti fino ad oggi. Analisi multi-omic, tuttavia, sono sfide di preparazione del campione, poiché estrazioni separate sono in genere necessari per ciascuno studio di omic, amplificando così notevolmente il tempo di preparazione e la quantità di campione richiesto. Per risolvere questa limitazione, è stato creato un metodo 3-in-1 per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi (MPLEx) dallo stesso campione di suolo adattando un approccio a base di solvente. Questo protocollo MPLEx ha dimostrato di essere sia semplice e robusto per molti tipi di campioni, anche quando utilizzati per quantità limitate di campioni di terreno complesso. Il metodo MPLEx abilitato anche notevolmente le misurazioni di rapida multi-omic necessari per acquisire una migliore comprensione dei membri di ogni comunità microbica, mentre la valutazione dei cambiamenti in atto su perturbazioni biologiche ed ambientali.

Introduzione

Valutazione comunità microbica del suolo ha importanti implicazioni per la comprensione di carbonio in bicicletta e il cambiamento climatico. Recenti studi hanno tuttavia evidenziato difficoltà, come la mancanza di genomi sequenziati per microbiota in vari tipi di suolo e la funzione sconosciuta di molte delle proteine rilevate. Questi risultato di sfide a causa del terreno essendo più complessa comunità microbica conosciuti alla data di^1,2,3. Analisi multi-omic, che combinano risultati da metagenomica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomica e studi lipidomica, recentemente sono stati implementati in numerosi studi di terreno per ottenere una maggiore comprensione i microbi presenti, mentre ottenere informazioni complete circa i cambiamenti molecolari che avvengono a causa di perturbazioni ambientali^1,4,5. Una sfida con multi-omic studi è che la spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic, metabolomica e lipidomica misurazioni in genere richiedono un processo di estrazione specifica per ogni omic MS compatibile^{6,7 , 8 , 9}. queste precise procedure subordina l'applicazione estremamente difficili o impossibili quando solo una limitata quantità di campione è disponibile. Queste sfide ci hanno spinti a studiare una simultanea metabolita, della proteina e del lipido (MPLEx) metodo di estrazione capace di usando più piccoli volumi di campione o masse, migliorando la precisione e fornendo più veloce preparazione del campione per tutte le tre analisi ¹⁰. ad oggi, esistono procedure estrazione alternativi del suolo che possono raggiungere tutti questi obiettivi.

Per attivare globale multi-omic analisi di un campione di terreno unico, un protocollo di estrazione con solvente organico basato su cloroformio, metanolo e acqua separazioni era utilizzato¹⁰. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per lipido totale estrazioni^9,11 e più recentemente è stato modificato per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi da un singolo campione^{12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30}, consentendo la meno quantità di campione e variabilità sperimentale¹⁰. Nel protocollo MPLEx, cloroformio non è miscibile con acqua, che costituisce la base per la separazione chimica trifasica dei costituenti del campione in frazioni distinte. Di conseguenza, la fase acquosa superiore contiene i metaboliti idrofili, seguiti da un disco di proteine e poi uno strato di lipidi nella fase di cloroformio di fondo (Figura 1). Quando MPLEx viene applicato alla maggior parte dei suoli, residui di particolato si accumulano nella parte inferiore dei tubi di campionamento e possono essere eliminato dopo aver raccolgono tutti i livelli. Ogni tipo di suolo può essere differente, tuttavia e in terreno altamente organico quali torba, i detriti del terreno rimane nello strato intermedio e non cadono sul fondo del tubo di campionamento. MPLEx offre diversi vantaggi quando isolare la molecola più tipi dallo stesso campione come 1) piccole quantità di campione può essere utilizzato per le analisi multi-omic, 2) multi-omic estrazioni dalla stessa diminuzione di campione variabilità nel complesso sperimentale, e 3) una maggiore quantità di campioni può essere preparato molto più veloce per maggiore velocità effettiva studi¹⁰. Insieme, questi vantaggi sono vitali per fornire la migliore capacità di misurazione per la valutazione di campioni di terreno e loro comunità microbiche complesse.

Protocollo

Nota: Terreni molto bagnati possono essere liofilizzati prima dell'estrazione senza pregiudicare l'efficacia dell'estrazione. Terreno bagnato può anche essere usato, ma dovrebbe essere considerato quando si aggiungono i reagenti specifici rapporti.

Nota: Si consiglia di utilizzare 20 g di peso secco del terreno per estrazione, che deve essere diviso tra due provette da 50 mL (massimo di suolo 10g per tubo da 50 mL). Le estrazioni possono essere scalate in su o in giù dipende dal campione disponibile.

Nota: I campioni di terreno asciutto possono essere setacciati attraverso uno schermo di 3 mm al fine di omogeneizzare e rimuovere rocce e piccole radici. Campioni di suolo bagnato, non del setaccio come il campione si blocca nella schermata.

1. terra lisi delle cellule e l'estrazione di metaboliti, proteine e lipidi (Timing ~ 1 d)

1. Al campione di suolo di 20 g, pesare 10 g in due tubi separati 50 mL che sono metanolo/cloroformio compatibile. Essere molto attenti con i tubi scelti, come cloroformio percolare la maggior parte delle plastiche, contaminando i campioni. Utilizzare il vetro ogni volta che possibili o plastica tubi realizzati in polipropilene o politetrafluoroetilene (PTFE).
   Nota: Mantenere il terreno sul ghiaccio e come fresco come possibile durante le fasi iniziali di pesatura e omogeneizzazione.
2. Aggiungere 10 mL di cloroformio-lavato in acciaio inox e granati perline ad ogni provetta. Il ghiaccio, aggiungere 4 mL di freddo ultrapura acqua (Vedi Tabella materiali per impianto di depurazione) in ogni provetta (uno campione split tra i due tubi) e trasferire i campioni in un secchio di ghiaccio in una cappa aspirante.
3. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro di 25 mL, rapidamente aggiungere 20 mL di ghiaccio 2:1 cloroformio: metanolo (v/v).
   Attenzione: Cloroformio: metanolo ha effetti potenziali sulla salute acuti: pelle irritazione, possibili ustioni chimiche e irritazione alle vie respiratorie. Può interessare i reni, fegato e cuore. Indossare guanti, indumenti e occhiali di protezione adatti e lavorare sempre in una cappa aspirante.
4. Serrare i coperchi e vortice nella soluzione. 2:1 choloroform:methanol aiuta a rompere la parete cellulare dei procarioti ed inattiva anche attività enzimatiche.
5. Se possibile, fissare i tubi da 50 mL tubo vortex allegati e orizzontalmente vortexare per 10 min a 4 ° C all'interno di un frigorifero. Quindi, inserire i campioni all'interno di un congelatore-80 ° C per circa 15 min per raffreddare completamente.
6. Utilizzando un sonicatore sonda all'interno di una cappa aspirante, Sonicare ogni campione con una sonda di 6 mm (1/4") a ampiezza 60% per 30 s ogni sul ghiaccio.
   Attenzione: Si consiglia di utilizzare un suono di cedimento, custodia e cuffie di protezione mentre sonicating. Alta tensione è presente il cavo di alimentazione e ad alta frequenza di alimentazione. Evitare di toccare la parte inferiore o i lati della nave del campione con una sonda attiva; si può rompere o fondere la plastica.
7. Posizionare i campioni nel congelatore-80 ° C per circa 15 min, come sonicating può generare un sacco di calore.
8. Ripetere i passaggi da 1.5-1.7.
   Nota: Assicurarsi che i campioni di rimanere freddi durante tutta la procedura di lisi.
9. Centrifugare i campioni a 4.000 x g per 5 min, 4 ° C. A questo punto, il campione sarà divisi nello strato superiore del metabolita, l'intercalare di proteina e il più basso strato lipidico (e pallina restante di detriti). Vedere la Figura 1.
10. I campioni su ghiaccio nel secchiello del ghiaccio e, all'interno di una cappa aspirante e utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL, rimuovere i livelli di metabolita superiore dalle due provette da 50 mL in flaconcino di vetro di grandi dimensioni una.
    Nota: Evitare di aspirare qualsiasi del livello di proteina nella pipetta; lasciare un piccolo strato di metabolita se necessario.
11. Inclinare leggermente il tubo da 50 mL per rilasciare l'intercalare di proteina, in modo che è fluttuazione libera al momento lo strato lipidico inferiore. Con una spatola di laboratorio testa piatta di acciaio inossidabile pulito accuratamente scoop entrambi degli intercalari proteina e metterli insieme in una nuova provetta da 50 mL.
12. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro 25ml, rimuovere gli strati più bassi del lipido in un flaconcino di vetro di grandi dimensioni.
    Nota: Cercate di evitare gli aspiranti particelle di suolo; Tuttavia, alcuni suolo detriti e particelle aspiravano lungo con i lipidi verranno rimosso in un secondo momento.
13. Posto membrane traspiranti sopra la parte superiore del metabolita e lipidica flaconi in vetro e asciugare in un concentratore a vuoto fino a secchezza (lipidi ~ 4-5 h, metaboliti durante la notte).
14. La provetta del campione di proteina e i rimanenti tubi pellet di detriti, aggiungere 20 mL di metanolo ghiacciato a ciascuno e vortex. Questo viene fatto per i pellet di detriti per lavare via cloroformio prima di tentare di solubilizzare eventuali possibili proteine restanti fuori i detriti prima di buttarla.
15. Centrifugare i detriti pellet e le proteine dello strato intermedio a 4.000 x g per 5 min, 4 ° C, poi decantare il metanolo in un contenitore di rifiuti pericolosi all'interno di una cappa aspirante.
16. Congelare le palline di proteine e detriti in azoto liquido e asciugare in un liofilizzatori (con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C a causa di metanolo con un molto basso punto di congelamento di-98 ° C) per ~ 2 ore.
    Nota: Non asciugare troppo i pellet, quanto saranno più difficili da sciogliere.
17. Aggiungere 10 mL di buffer di solubilizzazione della proteina (4% SDS, 100mM DTT (DL-dithiothreitol) in tampone tris 50mM, pH 8.0; si veda Supplementari reagente set-up) al tubo dello strato intermedio della proteina e 20 mL a ciascuno dei pellet detriti.
    Attenzione: SDS causa tossicità acuta ed è infiammabile. È una pelle, occhi e irritante delle vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
18. Nella cappa fumi, sonda ultrasuoni i campioni ad ampiezza di 20% per 30 s per portarli in soluzione. Vortex per 2 min.
19. Inserire l'esempio dello strato intermedio di proteina in un rotatore del tubo di laboratorio a 300 giri/min, 50 ° C, per 30 minuti per solubilizzare le proteine.
20. Orizzontalmente vortice i campioni di detriti per altri 10 min a lisare eventuali restanti cellule intatte, quindi ruotare con i campioni dello strato intermedio della proteina per il restante 20 min.
21. Tutti i campioni a 4.500 x g per 10 min, temperatura ambiente (TA), centrifugare e raccogliere il surnatante da ciascuna provetta per campione in due provette da 50 mL.
22. Aggiungere 10 mL di solubilizzazione del buffer al pellet di proteine dello strato intermedio, quindi sottoporre ad ultrasuoni e vortice in soluzione e centrifugare di nuovo come prima.
23. Combinare ugualmente i surnatanti nelle due provette da 50 mL e centrifugare a 8.000 x g per 10 min, 4 ° C, in un rotore ad angolo fisso.
    Nota: Una centrifugazione finale è necessaria rimuovere sostanze umiche contaminazione eccessiva.
24. Decantare i surnatanti in due provette da 50 mL in modo che c'è 30 mL in ciascuna. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL, aggiungere 7,5 mL di TCA (acido tricloroacetico) ad ogni provetta. Vortice in soluzione. Questo rende 20% TCA in ciascun campione di 30 mL (regolare di conseguenza),
    Attenzione: TCA è caustica, tossica e maggio causare ustioni della pelle. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.
25. Posizionare i campioni in un congelatore a-20 ° C per 2 h per una notte.
    Nota: Proteine precipitano in genere entro 1 h ma possono essere lasciato durante la notte (fino a 18 h).
    Nota: Non lasciare che l'estrazione del TCA andare più di 18 h a causa di possibile idrolisi acida della proteina. Se il campione è congelato, scongelare su ghiaccio; non lasciare che il campione scaldare passato disgelo.
26. Per pellet la proteina precipitata, centrifugare il campione a 4.500 x g per 10 min, 4 ° C e decantare il supernatante in rifiuti.
27. Aggiungere 10 mL di acetone ghiacciata 100% per ogni pallina di proteina, vortice e si combinano come pellet in una provetta.
28. Centrifugare la provetta contenente il pellet combinato (usando una bilancia) e quindi decantare il supernatante in rifiuti.
    Attenzione: Acetone può causare delle vie respiratorie e irritazione cutanea e oculare ed è un liquido e vapori infiammabili. Indossare un camice da laboratorio e occhiali di protezione guanti, lavoro in una cappa aspirante.
29. Lavare la pallina due volte con 1,5 mL di acetone e infine trasferimento in una provetta da 2 mL per la centrifuga finale a 10.000 x g per 5 min.
30. Decantare il supernatante in rifiuti e lasciar invertito il pellet ad asciugare su una salvietta di carta in una cappa per ~ 20 min o sotto un flusso di azoto fino a quando la pallina inizia leggermente a crepa.
31. 100-200 µ l di buffer di solubilizzazione di proteina, a seconda della dimensione del pellet.
    Nota: Tenere il volume di tampone di solubilizzazione aggiunto al campione più basso possibile. Successivi filtro Aided campione preparazione (FASP) può utilizzare solo fino a 50 μL di campione solubilizzato per colonna; qualsiasi più deve essere suddiviso in più colonne FASP.
32. Sottoporre ad ultrasuoni e vortice la pallina nella soluzione. Si noti che il campione può essere viscoso a causa di sostanze umiche precipitando insieme con la proteina, che sarà rimossi con una successiva centrifugazione.
33. Agitare il campione in un incubatore/agitatore per 30 min a 300 giri/min, 40 ° C, per solubilizzare le proteine in soluzione e procedere alla digestione delle proteine.
34. Snap congelare il campione in azoto liquido e conservare in un congelatore a-80 ° C fino al momento per la digestione delle proteine.

2. lipidi preparazione (temporizzazione ~ 20 min)

1. Una volta che i campioni del lipido sono asciutti, aggiungere 200 μL di 2:1 cloroformio: metanolo nel flaconcino, vortice in soluzione e trasferimento in una provetta da 1,5 mL in polipropilene, di aggiungere un ulteriore 200 μL al vetro fiala, vortice e pipettare i lipidi rimanenti e trasferire al tubo.
2. Centrifugare i detriti fuori il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C.
3. Trasferire il surnatante in un flaconcino di vetro del lipido e conservare a-20 ° C fino all'analisi LC-MS/MS (ulteriori dettagli per LC-MS/MS in Metodi supplementari).
4. Se i campioni non possono essere analizzati immediatamente dopo la preparazione, i lipidi devono essere memorizzati in solvente a-20 ° C per evitare ossidazione e degradazione.

3. metabolita preparazione e derivatizzazione (temporizzazione ~ 5 h)

1. Il giorno dopo l'estrazione, rimuovere i campioni di metabolita dal Vac velocità e memorizzare secco a-20 ° C fino al momento per la derivatizzazione e analisi sul GC. Se non in esecuzione i metaboliti su un GC, poi prepararli utilizzando il protocollo appropriato per lo strumento.
2. Immediatamente prima di derivatizzante i metaboliti per analisi sul GC, trasferirli dalle fiale di vetro di grandi dimensioni con l'aggiunta di 200 μL di metanolo, Vortex e aggiungendo ad un tubo in polipropilene 1,5 mL. Ripetere una volta.
3. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 10 min, 4 ° C. Trasferire il surnatante in piccole fiale di vetro, aggiungere una membrana traspirante nella parte superiore e completamente asciutta in un Vac di velocità.
4. I metaboliti di derivatizzare aggiungendo 20 µ l di soluzione di dimethylamine la fiala del campione e vortex per 30 s su un Vortex a velocità media.
   Attenzione: Dimethylamine cloridrato provoca gravi ustioni e gravi lesioni oculari, può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Indossare occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cappa aspirante.
5. Utilizzare un sonicatore vasca per garantire che il campione è completamente sciolto.
6. Incubare il campione in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione mantenuto a 37 ° C per 1 h e 30 min con 1.000 giri/min agitazione.
7. Capovolgere il flaconcino una volta per mescolare i campioni con gocce di condensate sulla superficie del tappo. Selezione del campione verso il basso a 1.000 x g per 1 min, RT
8. Eseguire la sililazione aggiungendo 80 µ l (usando una siringa) di N-metil - N-(trimetilsilile) trifluoroacetamide con trimethylchlorosilane di 1%. Vortexare per 10 sec.
   Attenzione: Massimiliano + 1% TMC può causare corrosione cutanea, lesioni oculari gravi e tossicità d'organo specifica ed è un liquido e vapori infiammabili. Indossare occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cappa aspirante.
9. Incubare il campione in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione mantenuto a 37 ° C per 30 min con 1.000 giri/min agitazione.
10. Capovolgere il flaconcino una volta per mescolare i campioni con gocce di condensate sulla superficie del tappo.
11. Selezione del campione verso il basso per 5 min a 2.000 x g, RT
12. Trasferire la soluzione ha reagita in fiale appropriati per l'analisi GC-MS.

4. proteine digestione (tempi d ~ 1)

1. Centrifugare il campione a 15.000 x g per 5 min, RT, a pellet eventuali detriti.
2. Eseguire filtro-Aided--preparazione del campione (FASP) la digestione utilizzando FASP Kit (Vedi Tabella materiali) seguente modifica istruzioni^{31,32 del produttore}:
   1. Aggiungere 400 μL di buffer urea 8 M in una colonna FASP (500 μL 30K MWCO filtro spin).
   2. Una volta che il campione ha finito di centrifugazione, pipettare il sovranatante (scartare il pellet) e aggiungere fino a 50 μL del campione a 400 μL di 8m urea nella colonna.
      Nota: Aggiungere solo fino a 50 μL di campione per ogni colonna. Se non c'è più di 50 μL di campione, utilizzare più colonne e combinare i peptidi dopo la digestione. È meglio lasciare questo volume più basso possibile (30 µ l è ideale) al fine di garantire la FASP colonna rimuoverà tutti della SDS che può interferire notevolmente con analisi massa spec.
   3. Sistemare la colonna nel tubo incluso 1,5 mL e centrifugare il campione a 14.000 x g per 30 min, RT
   4. Rimuovere il flusso continuo in rifiuti e aggiungere 400 μL di 8m urea alla colonna e centrifugare nuovamente.
   5. Ripetere il passaggio precedente ancora una volta per un totale di 3 urea risciacqui.
      Nota: Assicurarsi che il campione va vicino secchezza sulla colonna, se c'è qualche più di ~ 30 µ l restante del filtro dopo ogni giro, continuare la centrifugazione.
   6. Aggiungere 400 μL di 50mm NH₄HCO₃ e centrifugare a 14.000 x g per 20 min, eliminare i rifiuti e ripetere una volta.
   7. Trasferire le colonne in una provetta da centrifuga pulito 1,5 mL.
   8. Aggiungere 75 μL di tampone di digestione della tripsina alle colonne e incubare a 37 ° C per 3 h in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione a 750 giri/min.
   9. Aggiungere 40 µ l di 50mm NH₄HCO₃ alle colonne.
   10. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 15 min raccogliere i peptidi nel tubo, mantenendo i contaminanti di alto peso molecolare in cima alla colonna.
   11. Aggiungere 40 μL di 50mm NH₄HCO₃ per la colonna e centrifugare di nuovo.
3. Scartare la colonna, a secco giù i peptidi nel tubo una Vac velocità di ~ 30 µ l e l'analisi BCA (kit di dosaggio di proteina acida bicinconinico; Vedi Tabella materiali) i peptidi.
4. Facoltativamente, eseguire un passaggio di pulizia se sospetta contaminazione SDS (visibili bolle)³³. Un'estrazione in fase solida deve essere fatto in seguito se si sceglie questa opzione. Informazioni dettagliate su questo metodo di pulizia sono disponibile nei Metodi supplementari.
5. Diluire il campione per analisi MS o facoltativamente procedere al frazionamento di HPLC (due passaggi successivi).
6. Per frazionare, diluire i campioni ad un volume di 400 µ l con tampone di 10 mM ammonio formiato (pH 10.0).
7. Risolvere su una colonna C18 (Vedi Tabella materiali) separando a 0,5 mL/min utilizzando un sistema HPLC con formiato di ammonio di fasi mobili (A) 10 mM, pH 10.0 e (B) formiato di ammonio 10 mM, pH 10.0/acetonitrile (10:90).
   1. Regolare il gradiente alla 100% al 95% A oltre il primo min 10, 95% A 65% A oltre min 10 a 70, A 65% a 30% A oltre 70 a 85, mantenere alla 30% A oltre min 85 a 95 min.
   2. Riequilibrare con 100% A oltre min 95 a 105 e tenere al 100% A fino a 120 min.
   3. Raccogliere le frazioni ogni 1,25 min (96 frazioni sopra l'intera sfumatura) e infine combinare ogni riga per un totale di 12 campioni o alterni per 24 campioni (ciascuno con n = 8 o n = 4 frazioni in pool).
8. Asciugare tutte le frazioni sotto vuoto e aggiungere 15 µ l di acqua ultrapura a ciascuno per la conservazione a-20 ° C fino all'analisi LC-MS/MS.

Risultati

Quando il protocollo MPLEx è stato utilizzato per estrarre le molecole da Kansas prairie nativo suolo (un Mollisol), l'analisi triplice copia fornito risultati per 3376 peptidi, 105 lipidi e 102 metaboliti polari (tutte le identificazioni uniche). Mentre il protocollo MPLEx è stato ben stabilito per estrazione generali di lipidi e metaboliti^12,13,14,15,

Discussione

È importante notare che non tutti i laboratori avranno la stessa attrezzatura disponibile così determinati metodi, ad esempio il passaggio di Lisi, possono essere adattati. Qui usiamo nel vortex e sonicating, tuttavia l'uso di un battitore di perlina grande 50 mL avrebbe funzionato. Se non sono disponibile un liofilizzatori con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C, i campioni possono essere essiccati sotto un flusso di azoto. Anche i tipi di suolo variano notevolmente e possono includere sabbia, limo, ar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498	Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Purified water from Millipore	Milli-Q		Water purification system.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L6026	!Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.
Soil protein extraction kit	MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen	30000-20
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T0699	!Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.
Urea	Sigma-Aldrich	208884	!Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses
Ammonium bicarbonate	Fluka	09830
Trypsin	Promega	V528A	20µg vials
Bicinchoninic acid protein assay kit	Pierce	23227
Ammonium Formate	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998	!Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	!Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904	!Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	!Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane	Sigma-Aldrich	69478	!Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q water purification system	Millipore		model MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Probe sonicator	FisherBrand		model FB505
Refrigerated centrifuge	Eppendorf		model 5810R
50mL tube swinging bucket rotor	Eppendorf	A-4-44
50mL fixed angle rotor	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		model V22PWE150IT
Serological pipette controller	Eppendorf	12-654-100
10mL, 25mL glass serological pipettes	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer with Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads	NextAdvance	SSB14B
0.15 mm garnet beads	MoBio	13122-500
Magnetic stir plate	FisherBrand	11-100-16SH
Magnetic stir bar	FisherBrand	14512130
pH paper strips, pH range 0–14	FisherBrand	M95903
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube	Genesee Scientific	21-103 21-108	chloroform compatible
50mL vortex attachment	MoBio	13000-V1-50
Ice bucket	FisherBrand	02-591-44
27.25x70mm glass vials	FisherBrand	03-339-22K
Breathe Easier plate membranes	Midwest Scientific	BERM-2000
Alcohol wipes	Diversified Biotech	BPWP-1000
Heater shaker incubator	Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analog rotisserie tube rotator	SoCal BioMed, LLC	82422001
Filter-Aided-Sample-Prep kit	FASP; Expedeon	44250
Microplate reader	Biotek, EPOCH
-20 Degree Celsius Freezer	Fisher	13986149
-80 Degree Celsius Freezer	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive ion trap mass spectrometer	Thermo Scientific
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC system	Millford, MA
250mL media bottle	FisherBrand	1395-250
Waters vial	Waters	186002805
Glass MS sample vial and inserts	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC vial and snap caps	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-well plate	Agilent	5042-6454
Large glass vial 27.25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Lyophilizer	Labconco	7934021
Polished stainless steel flat head spatula	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Kim wipes	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column	Waters	186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC system	Agilent Technologies	G1380-90000
1.7mL centrifuge tube	Sorenson	11700
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pasteur Pipettes	FisherBrand	13-678-20A
Pasteur Pipette Bulbs	Sigma-Aldrich	Z111597
Bath Sonicator	Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
Vacuum Centrifuge	Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
MicroSpin Columns, C18 Silica	The Nest Group	SEM SS18V