صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار

Published: May 7th, 2018

DOI:

10.3791/57511

J. Christopher Octeau¹, Guido Faas², Istvan Mody^1,2, Baljit S. Khakh^1,3

¹Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ²Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ³Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

أيونات البوتاسيوم تساهم يستريح إمكانات غشاء الخلايا والخلية ك⁺ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلوية. ونحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك⁺-ميكروليكتروديس انتقائية. استخدام هذه الأقطاب يتيح قياس ديناميات تركيز ك⁺ مقولة كهربائياً في شرائح هيبوكامبال الكبار.

أيونات البوتاسيوم تساهم مساهمة كبيرة في إمكانات غشاء يستريح من الخلايا، وذلك، خارج الخلية ك⁺ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلية. تغيير تركيزات من خارج الخلية ك⁺ يؤثر على استثارة الغشاء يستريح المحتملة والخلوية بالتحول في التوازنات بين الدول المغلقة والمفتوحة والمعطل لقنوات أيون تعتمد على الجهد التي تكمن وراء إمكانات العمل بدء والتوصيل. ومن ثم فإنها ذات قيمة لقياس ديناميات ك⁺ خارج الخلية في الصحة والدول المريضة مباشرة. هنا، نحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك⁺-ميكروليكتروديس انتقائية. قمنا بنشر لهم في شرائح المخ هيبوكامبال الكبار لقياس ديناميات تركيز ك⁺ مقولة كهربائياً. الاستخدام الحكيم لهذه الأقطاب هو جزء مهم من مجموعة الأدوات اللازمة لتقييم الآليات الخلوية والفيزيائية التي تتحكم في تركيزات ك⁺ خارج الخلية في الجهاز العصبي.

أحكام تنظم تركيزات أيون البوتاسيوم في الدماغ، وتقلباتها له تأثير قوي على إمكانات غشاء يستريح كافة الخلايا. وفي ضوء هذه الإسهامات الحاسمة، هو هدفا هاما لعلم الأحياء تحديد الآليات الخلوية والفيزيائية الحيوية التي يتم استخدامها لتنظيم محكم تركيز ك⁺ في الفضاء خارج الخلية في الأجهزة المختلفة ل الجسم¹ ^, ²-شرط هام في هذه الدراسات هو القدرة على قياس تركيزات ك⁺ بدقة. على الرغم من أن العديد من العناصر التي تسهم في التوازن البوتاسيوم في الدماغ في الدول السليمة والمريضة قد حددت³^،^،من⁴⁵، تباطأ التقدم كذلك بسبب....

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا "المعهد الوطني للدليل الصحي" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها "لجنة البحوث الحيوانية" المستشار في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس. تم إيواء جميع الفئران مع تتوفر الأغذية والمياه libitum الإعلانية في بيئة ضوء الظلام ح 12. جميع الحيوانات.......

للقياس الانتقائي لخارج الخلية ك⁺، نحن على استعداد ميكروليكتروديس الأيوني الانتقائي مغطاة بطبقة مسعور من خلال سيلانيزيشن لتنظيف البورسليكات الزجاج الماصات (الشكل 1A). ويتيح هذا الطلاء إيونوفوري ك⁺ التي تحتوي على فالينوميسين للراحة في غيض مسرى .......

الأسلوب الذي يصف لنا هنا قد سمح لنا تقييم ديناميات ك⁺ استجابة للتحفيز الكهربائي للضمانات شافر في شرائح هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. لدينا طريقة لإعداد ك⁺ميكروليكتروديس أيون انتقائية مماثلة للإجراءات الموصوفة في وقت سابق¹²^،¹³^،^،

وأيد المختبر كاخ MH104069 المعاهد الوطنية للصحة. مختبر مودي أيده NS030549 المعاهد الوطنية للصحة. بفضل J.C.O. Grant(NS058280) التدريب رقائق العصبية في المعاهد الوطنية للصحة T32.

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW

McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: