Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma
Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K+ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.
Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini önemli ölçüde katkıda bulunmak, bu nedenle, ve ekstraselüler K+ konsantrasyonu hücre uyarılabilirlik çok önemli bir regülatör. Aksiyon potansiyeli altında yatan voltaj bağımlı iyon kanalları için kapalı, açık ve Inaktif devletler arasında denge ilerletmeniz istirahat membran potansiyeli ve hücresel uyarılabilirlik ekstraselüler K+ etkiler konsantrasyonları değişmiş başlatma ve iletken. Bu nedenle, doğrudan hücre dışı K+ dynamics sağlık ve hastalıklı Birleşik ölçmek için değerlidir. Burada, nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Biz onları elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics ölçmek için yetişkin Hipokampal beyin dilimler halinde dağıtılabilir. Böyle elektrotlar akılcı kullanımı ekstraselüler K+ konsantrasyonları sinir sisteminde kontrol hücresel ve biyofizik mekanizmalar değerlendirmek için gerekli araç kitinin önemli bir parçasıdır.
Potasyum iyon konsantrasyonlarının sıkıca beyinde düzenlenir ve onların dalgalanmaları istirahat membran potansiyeli tüm hücrelerin üzerinde güçlü bir etkisi uygulamak. Bu kritik katkıları ışığında Biyoloji önemli bir amacı sıkı K+ konsantrasyonu düzenlemek için kullanılan hücresel ve biyofiziksel mekanizmaları hücre dışı alan vücut1 farklı organlarda belirlemektir , 2. bu çalışmalarda önemli bir gereksinimi K+ konsantrasyonları doğru ölçmek için yeteneğidir. Sağlıklı ve hastalıklı Birleşik beyinde homeostazı potasyum katkıda birçok bileşeni tanımlanan3,....
Tüm hayvan deneyleri Ulusal Enstitüsü, Sağlık Rehberi uygun olarak bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için yapılmıştır ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Chancellor's hayvan Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi. Bütün fareler ile yiyecek ve su kullanılabilir ad libitum 12 h koyu ortamda muhafaza. Bütün hayvanlar hiçbir belirgin davranış değişiklikleri ile sağlıklı, önceki çalışmalarda dahil edilmemişlerdir ve ışık döngüsü sırasında kurban edildi. Deney.......
Hücre dışı K+seçici ölçüm için iyon-seçici microelectrodes temiz borosilikat cam Pipetler (şekil 1A) silanization ile hidrofobik bir tabaka ile kaplı hazırladık. Bu kaplama valinomycin elektrot uç vasıl dinlenme ve sadece K+ akı elektrot uç (şekil 1B) dar bir delikten izin vermeyi içeren K+ ionophore sağlar. Elektrotlar göre backfilled tuzlu çözüm ve K+ ionophor.......
Biz burada tarif yöntemi bize K+ dynamics yetişkin fareler tarafından yapılan yanıt Schaffer de¤erler akut Hipokampal dilimleri içinde elektrik stimülasyon olarak değerlendirmek izin verdi. K+ iyon seçici microelectrodes hazırlama bizim daha önce açıklanan yordamları12,13,14,15' e benzer bir yöntemdir. Ancak, hızlı ve basit K+ selektif microele.......
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved