Количественное определение морфологии микроглии от микрофотографиями иммуногистохимия подготовлен с использованием ImageJ ткани

Summary

Микроглии являются иммунные клетки мозга, которые обследования и реагировать на изменения мозга физиологии через морфологических изменений, которые могут быть оценены количественно. Этот протокол описывает ImageJ на основе анализа протокола для представления микроглии морфология как непрерывных данных согласно метрик, например клетки ветвления, сложности и формы.

Abstract

Микроглии являются фагоциты мозга, которые участвуют в мозг гомеостаза и непрерывно обследования окружающей их среды дисфункции, травмы и болезни. Как первый responders Микроглии есть важные функции для смягчения нейронов и глии дисфункции, и в этом процессе, они проходят широкий спектр морфологических изменений. Микроглии морфологии могут быть классифицированы описательно или, альтернативно, может быть определена количественно как непрерывной переменной для параметров, таких как клетки ветвления, сложности и формы. Хотя методы для количественного определения микроглии применяются для единичных клеток, несколько методы применяются к нескольким микроглии в весь Микрофотография. Этот метод предназначен для количественного определения нескольких и единичных клеток с помощью легко доступных ImageJ протоколов. Этот протокол является резюме шагов и плагинов ImageJ рекомендовала преобразовать флуоресценции и ярко поле микрофотографиями в представительных двоичные и каркасный изображения и проанализировать их с помощью программного обеспечения плагины AnalyzeSkeleton (2D/3D) и FracLac для сбора данных морфологии. Результаты работы этих плагинов суммировать морфологии клеток с точки зрения процесса конечные точки, развязок и длины, а также сложности, форма ячеек и размер дескрипторов. Скелет анализа протокола, описываемые хорошо подходит для регионального анализа нескольких микроглии в пределах всей Микрофотография или региона интерес (ROI), в то время как FracLac обеспечивает анализ дополнительных индивидуальных клеток. Комбинированные, протокол предоставляет объективную, чувствительной и всеобъемлющей оценки инструмент, который может использоваться для стратификации между разнообразными микроглии морфологии в мозг здорового и раненых.

Introduction

Микроглии есть немедленного и различных морфологических ответ на изменения в физиологии мозга¹ вдоль континуума возможностей диапазоне от гипер ветвления и весьма сложные морфологии для исключения из разветвленной и Саркодовые морфологии² . Микроглии может также стать поляризованные и палочковидные³. Микроглии клеток ветвления обычно определяется как сложную форму, имея несколько процессов и часто сообщается как количество конечных точек в клетку и длина клеточных процессов. Так как микроглии тонко настроены нейронов и глиальных функции посредством непрерывной ячеек кросс talk и в естественных условиях подвижности^4,5, микроглии морфологии может служить показатели функций различных клеток и дисфункции в головном мозге. Количественный подход необходимо адекватно описать разнообразие этих морфологических изменений и выделить различия между разветвленной клетки, которые происходят с тонкими физиологического возмущения (например, эпилепсии^5,6 и сотрясение⁷) в дополнение к грубой травмы (например инсульта⁸). Более широкое использование морфологии количественная оценка^{7,8,9,10,11,12,13,14} покажет все разнообразие микроглии морфологии во время болезни и здоровья. В настоящем исследовании детали поэтапного использования плагинов ImageJ необходимо обобщить микроглии морфология от флуоресцентных или не люминесцентные микрофотографиями микроглии приобрел в фиксированных грызунов ткани после иммуногистохимия (IHC).

Центральным для анализа методов, описанных здесь ImageJ плагины AnalyzeSkeleton (2D/3D)¹⁵, разработан в 2010 году для количественного определения больших молочных структур и FracLac¹⁶, разработанный в 2014 году интегрировать ImageJ и Фрактальный анализ количественную оценку отдельных микроглии фигур. Эти плагины предоставляют быстрый анализ микроглии ветвления в течение всего микрофотографиями или несколько микроглии определенной рентабельности в рамках Микрофотография. Этот анализ может использоваться отдельно или в комплекте с Фрактальный анализ. Одноклеточных Фрактальный анализ (FracLac) требует инвестиции времени, но предоставляет множество выходов морфология относительно сложности микроглии, форма и размер. Использование обоих инструментов не является избыточным, как клетки ветвления дополняет сложности клеток, и комбинация нескольких параметров может использоваться для различения различных микроглии морфологии в рамках наборов данных^12,17.

Protocol

Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными университета штата Аризона институционального ухода за животными и использовать Комитет и руководящие принципы НИЗ для ухода и использования лабораторных животных. Внимание было уделено минимуму животных боль и дискомфорт. Методы эвтаназии согласно утвержденным протоколом и состоят из шейки матки обезглавливание под изофлюрановая наркозом.

1. Подготовка тканей

Примечание: Провести анализ морфологии микроглии на фиксированной, образцы тканей cryoprotected для сохранения морфологии клеток. Ниже приведен стандартный протокол для подготовки и непосредственно ломтик фиксированных тканей для флуоресценции IHC.

1. Удаление мыши или крысы мозги Усыпленных животных после желаемого эксперимента и согласно протоколу Стандартный лабораторный. Поместите мозга в 10 мл флакон с 5 мл 4% раствора параформальдегида для 24 ч при 4 ° C. Затем сполосните и место в 5-10 мл 30%-ая сахароза фосфата буферизуются решение (PBS, 0,01 М) за 72 ч при 4 ° C. Хранить весь мозг на-80 ° C до разрезания ткани с криостат, или на 4 ° C, если секционирование с микротома.
   Примечание: Этот протокол имеет еще не были протестированы с использованием ткани, нарезанный от парафин врезанных тканей.
2. В разделе ткани мозга в нужный раздел толщина и ориентации с помощью криостата или микротома и хранить свободные секций в растворе криозащиты (50 мм PBS, этилен гликоль, глицерин) при-20 ° C.
   Примечание: Этот протокол был успешно осуществил на разделах корональных ткани от 50 мкм до 200 микрон в толщину. Ткани, разделы меньше чем 50 мкм не может захватить полный диапазон микроглии процессов, в то время как в разделах толстые ткани, ИГХ окрашивания могут быть несовершенным вследствие антитела проникновения в ткани. Ткани могут быть либо секционного в корональных или сагиттального ориентации, и этот выбор будет зависеть от экспериментальных цели и мозг регион(ы) необходимо изучить.

2. иммуногистохимии

Примечание: Скелета и фрактальные методы анализа могут применяться для флуоресценции или 3, 3 ' диаминобензидин (DAB) IHC. Следующее является стандартным флуоресценции IHC протокол и может быть заменен при необходимости. Флуоресценции IHC дает превосходной визуализации клеточных процессов по сравнению с DAB IHC.

1. Поместите в разделах ткани в 4 мл во флаконе стекла (до 15 мыши мозга разделы/флакона) и инкубировать с 1 мл раствора, содержащего до 10% лошадь сыворотке, PBS (0.01 М), 0,5% Тритон, 0,04% НАН₃ при комнатной температуре (23 ° C) за 1 ч.
2. Вымыть за 5 мин с PBS (0.01 М) три раза при комнатной температуре.
3. Проинкубируйте с основного антитела (Iba1, 1:1, 000) при комнатной температуре за 72 ч в 1 мл раствора, содержащего PBS (0.01 М), 0,5% Тритон, 0,04% НАН₃и покрыты (для сохранения эффективности₃ NaN).
4. Вымыть за 5 мин с PBS (0.01 М) три раза при комнатной температуре.
5. Проинкубируйте с вторичное антитело (анти кролик 488, 1: 250) распространяется на комнатной температуре в течение 4 ч в 1 мл раствора, содержащего PBS (0.01 М), 0,5% Тритон, 0,04% НАН₃
6. Вымыть за 5 мин с PBS (0.01 М) три раза при комнатной температуре.
7. Монтирования разделов ткани мозга (количество и ориентации на основе предпочтений) subbed слайды, применять средства монтажа мягкой набор на слайд и поместите coverslip ткани. Хранить слайды при 4 ° C.
   Примечание: Толщина 1,5 стекла coverslip требуется для конфокальная томография. Софт набор является средством предпочтительным монтажа, потому что высокая вязкость не сжимать ткани и лучше сохраняет морфологии, когда по сравнению с hard-set монтаж средств массовой информации.

3. томография

1. Изображение Iba1 клеток в разделе ткани мозга, используя ярко поле или Конфокальный микроскоп, который имеет возможность приобретения z стека с помощью 20 X объективных или больше.
   Примечание: Параметры и настройки программного обеспечения должна быть постоянным для всех Микрофотография приобретения в эксперименте. Отличный процесс подробно получается с помощью 40 X или 63 X цели. Это позволяет применять протокол скелет анализа, описываемые всего Микрофотография или ROI нескольких ячеек в пределах крупных Микрофотография.
   1. Приобрести 8-битные изображения с помощью соответствующего программного обеспечения параметров, характерных для Микроскоп программного обеспечения.
      Примечание: Преобразование файлов в 8-битных после приобретения может исказить коллекции данных.
   2. Приобрести по крайней мере 30 мкм z стек с не более чем 2 мкм интервал между изображениями с использованием соответствующего программного обеспечения параметров, характерных для Микроскоп программного обеспечения.
      Примечание: Микроскоп и программное обеспечение должно позволить для захвата изображений в X, Y и Z оси. Z стек может быть увеличен, и интервала могут быть уменьшены предоставлять дополнительные микроглии деталь. В обмен визуализации времени будет увеличиваться. Возможности используйте Найквиста выборки для микроскопии флуоресцирования.
2. Сохраните все файлы, как Tif файлов или как того требует программного обеспечения микроскопа.
3. Открыть файлы Tif в ImageJ и используйте панель инструментов для разделения каналов, нажав изображение | Цвет | Разделить каналыи стек изображений, нажав изображение | Стеки | X проекта | Максимальная интенсивность проекции при необходимости. Сохраните как файлы TIF.

4. скелет анализ

1. Скачать Фиджи или ImageJ от < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Для отдельных плагинов, скачать AnalyzeSkeleton(2D/3D) от < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>¹⁵ и скачать FracLac от < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>¹⁶.
   Примечание: Весь процесс преобразования Микрофотография в двоичном каркасный занимает менее 1 мин.
2. При использовании флуоресценции Микрофотография, убедитесь, что изображение является 8-битовым и преобразовать в градации серого лучше визуализировать все положительный пятнать. Использование панели инструментов и нажмите изображение | Таблицы подстановки | Грейс. При использовании DAB ярко поле фотография, первого использования FFT полосовой фильтр плагин (с помощью панели инструментов, нажав процесс | БПФ | Полосовой фильтр), а затем преобразовать в градации серого.
   Примечание: Для целей настоящего Протокола, ImageJ параметры по умолчанию для FFT фильтр полосы являются достаточно (фильтр до 3 пикселей, до 40, не полоса подавления). Применяя FFT полосовой фильтр удаляет шум (малые функции) при сохранении общей крупные аспекты изображения. Это особенно полезно в светлые области изображения, где расщепляется и трещин в ткани может появиться как фон и таким образом осложнить скелет анализа¹⁸.
3. Отрегулируйте яркость и контрастность, если изображение слишком тусклое и не могут быть визуализированы микроглии процесс. Использование панели инструментов и нажмите изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность. Отрегулируйте ползунки, минимум или максимум, при необходимости, до края гистограммы, но не дальше.
   Примечание: В ImageJ, яркость и контрастность изменяются путем обновления таблицы подстановки изображения (LUT), поэтому значения пикселей являются неизменными. Max и min ползунков управления нижнего и верхнего пределов диапазон отображения значений пикселов выше 255, появляется белый и значений пикселов ниже 0, появляются черные¹⁸. В случае флуоресценции микрофотографиями должны использоваться максимум ползунок, тогда как минимум ползунок будет использоваться для микрофотографиями DAB, окрашенных микроглии.
4. Запустить фильтр Unsharp Mask для дальнейшего увеличения контрастности с помощью панели инструментов, нажав процесс | Фильтры | Нерезкая маска. Для целей настоящего Протокола, параметры по умолчанию ImageJ (пиксель радиусом 3 и маска вес 0,6) используются.
   Примечание: Маски нерезкости обостряет и расширяет возможности края изображения путем вычитания размытым версии изображения (Unsharp Mask), из оригинала, а затем Слияние результирующего изображения с высокой контрастностью версией исходного изображения. Таким образом фильтр Unsharp Mask не создавать детали, но скорее разъясняет существующие деталей в изображении. Радиус параметр изменения как размытые Нерезкая маска будет (и таким образом сколько размытия будет удалена), и маска вес установки изменения степень контраста, что Нерезкая маска будет объединен с (и таким образом регулирует контраст изображения).
5. Выполните шаг фильтр для удаления salt-and-pepper шума, создаваемого Unsharp Mask. Использование панели инструментов и нажмите процесс | Шум | Очистить от.
   Примечание: Удаление пятен удаляет salt-and-pepper шум, заменив каждый пиксель значение медианы в окрестности 3 × 3. Эффект является, что выбросы интенсивности заменяются средний пиксел не затрагивая резкости краев¹⁸.
6. Преобразовать изображение в двоичный файл с помощью панели инструментов, нажав изображение | Отрегулируйте | Порог.
   Примечание: Бинаризация территории изображения в градациях серого в особенности интерес против фон и преобразует изображение в двоичные¹⁸.
7. Применить despeckle, близко-и удалить останцы функции: В результате двоичного образа, может быть один пиксель фоновый шум и пробелы между процессами.
   1. Применить despeckle функция, с помощью панели инструментов, нажав процесс | Шум | Очистить от.
      Примечание: Применение ретушь к двоичному файлу изображение удаляет любые оставшиеся шум одного пикселя.
   2. Применить функцию закрыть с помощью панели инструментов, нажав процесс | Двоичные | Закрыть.
      Примечание: Этот плагин соединяет два темных пикселей, если они разделены на 2 пикселя.
   3. Примените функцию останцы удалить с помощью панели инструментов, нажав процесс | Шум | Удаление нетипичные.
      Примечание: Для целей настоящего Протокола, яркие останцы ориентированы с пиксель радиусом 2 и пороговое значение 50. Этот плагин заменяет яркие или темные останец пиксель на средний пикселов в окрестности, если оно отклоняется более чем определенного значения (порог)¹⁸.
8. Сохранить изображение как отдельный файл для будущего использования и/или фрактального анализа и Скелетонизация изображения с помощью панели инструментов, нажав процесс | Двоичные | Скелетонизация.
9. Выберите изображение, каркасный и запустить плагин AnalyzeSkeleton(2D/3D) с помощью панели инструментов, нажав плагины | Скелет | Анализировать скелети флажок филиал информации.
   Примечание: Вполне вероятно, что обработка изображений потребует оптимизации с помощью добавления или удаления выше предлагаемых шагов. В этом процессе каркасный изображения для точности оцениваются Создание накладываемого скелета и исходное изображение. СОСМ должно быть точек одного происхождения с процессами, вытекающих из центра; круговой СОСМ смешивать данные и следует избегать через протокол перестройки. Пример единого происхождения точки против круговой СОСМ показано на рисунке 1.

Общие проблемы, что приводит к не представитель скелеты и предлагаемые решения:

• Изображение слишком тусклое: преобразование в оттенки серого, отрегулировать яркость/контрастность ползунков или применить Нерезкая маска
• Слишком много фон: Отрегулируйте Слайдер Яркость/контраст, применить Despeckle и/или удалять промахов
• Круговой СОСМ каркасный изображения (особенно для флуоресценции изображений): применить FFT полосовой фильтр, или контурная
• Трещины в ткани (особенно для светлые области изображения): БПФ полосовой фильтр, или удаление пятен

10. Скопируйте все данные из результатов и Отделение информационных мероприятий и вставить данные в таблицу Excel.
11. В Excel усекая данные для удаления скелет фрагменты, которые в результате приобретения IHC и изображения.
    1. Дублировать книгу эксперимент с результатом скелет анализа исходных данных и добавьте отделкой к имени файла. Все последующие данные обрезки должно происходить в дублированных книги для сохранения исходных данных для использования в будущем и ссылки.
    2. Определите, какой длины фрагменты будут обрезаны из набора данных, открыв каркасный изображения в ImageJ и выбрав инструмент линия. Измерить несколько фрагментов, принимая к сведению средней длины и решение о пороговое значение.
       Примечание: Для целей данные, представленные здесь, отсечки для нежелательные фрагменты длиной 0,5. Это значение должно быть постоянной в течение всего набора данных.
    3. Пользовательский сортировки таблицы Excel, нажав Сортировка и фильтр | Пользовательская сортировка. Сортировать по «вокселей конечной точки» от крупнейших маленький и в новом уровне, путем «Mx филиал pt» от наибольшего к наименьшему.
    4. Удалите все строки, содержащей 2 конечных точек с максимальной филиал длиной меньше, чем пороговое значение (т.е.., 0,5). Сумма данных в столбце конечные точки, чтобы вычислить общее количество конечных точек собрана из образа.
    5. Повторите эти действия для отделения информации данных: Сортировать по «филиал длина» от крупнейших в наименьший. Просмотрите данные и удалить каждую строку, которая имеет длину филиал меньше порогового значения(т.е.., 0,5). Суммировать значения в столбце Длина ветви для расчета суммарного длины всех ветвей, собранные из образа.
    6. Повторите шаги 4.11.3-4.11.5 для каждого изображения/листа до тех пор, пока все данные были обрезаны и суммируются.
    7. Разделите данные из каждого изображения (суммируется число конечных точек и подвел филиал длина) количество СОСМ микроглии в соответствующее изображение. Введите в статистическое программное обеспечение окончательные данные (конечные точки/клетка & филиал длина/клетка).
       Примечание: Суммируются филиал длина/ячейки данных может потребоваться преобразование Длина таблицы в пикселах в мкм.

5. Фрактальный анализ

Примечание: FracLac является возможность запустить ряд анализов различной формы, которые не охвачены в настоящем Протоколе. Для более подробного объяснения FracLac различные функции, смотрите руководство по FracLac в < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> и связанные ссылки ^2,16,19. Фрактальный анализ использует протокол шаги 4.1-4.7, описанных выше.

1. Определите размер Руа, который будет использоваться для всех Фрактальный анализ. Используйте инструмент прямоугольник для рисования ROI. Убедитесь, что поле является достаточно большой, чтобы захватить всю ячейку и может оставаться постоянной в течение всего набора данных.
   Примечание: Используйте прямоугольное выделение, вместо того, чтобы руки отбора для обеспечения всех ROIs же размера прямоугольника, и поэтому, клетки имеют той же шкале. Это не будет случай, если руки выбора были использованы, потому что ImageJ будет автоматически масштабировать квадратных рентабельности с учетом различных размеров прямоугольные окна, результате клетки с различными весами. В то время как фрактальных фигур не зависят от масштаба, процесс анализа фрактал, используя FracLac для ImageJ зависит от масштаба¹⁶. Таким образом существует необходимость постоянно размера ROI на протяжении всего сбора данных.
2. Случайным образом выберите микроглии фрактального анализа в каждом Микрофотография и соответствующий двоичный образ. В окне диспетчера ROI выберите Обновление для блокировки ROI на позицию ячейки. Использовать сочетание клавиш Ctrl + Shift + D для дублирования область в пределах ROI в новом окне, а затем сохранить обрезанное ячейки. На изображении соответствующий двоичный (от скелета анализа) дублировать области с той же ячейке с помощью диспетчера ROI. Повторяйте до тех пор, пока достаточное количество клеток были случайным образом выбраны для фрактального анализа и сохраните все файлы.
   Примечание: Генератор случайных чисел и пронумерованных сетка может использоваться для произвольно выбрать ячейки.
3. Откройте двоичное изображение с отдельной ячейки. Дважды щелкните инструмент «кисть», задайте цвет черный и при необходимости измените ширину кисти. С помощью сопоставления Микрофотография как ссылка, используйте кисть для удаления прилегающих клеточных процессов, соединения фрагментации процессов и изолировать клетки интереса. После того, как двоичные ячейки был изолирован, сохраните двоичный файл.
   Примечание: Холдинг «alt» будет переключаться кисть из цвет переднего плана (черный) (белый) цвет фона.
4. Преобразование двоичных ячейки в наброски с помощью панели инструментов через процесс | Двоичные | Контур.
   Примечание: FracLac для изображений J может использоваться либо твердых фигур или форму очертания, однако, нынешняя Конвенция использовать форму излагаются¹⁶.
5. В панели инструментов, откройте FracLac с помощью панели инструментов, нажав плагины | Фрактальный анализ | FracLac и выберите пункт до н.э. (поле подсчет). В параметрах Сетки дизайна равным 4 Num G . В разделе Параметры графики установите флажок метрики для анализа выпуклой и ограничивающий круг ячейки. Когда закончите, нажмите кнопку ОК.
   Примечание: Num G поле число подсчета ориентации сетки используется во время сканирования и рекомендуемый диапазон для Num G 4-12. Параметр Num G и предлагаемый ассортимент тщательно рассматривается в ручной FracLac¹⁶. Увеличение Num G может значительно замедлить время вычислений. FracLac параметры только нужно будет установить один раз за сеанс. После ввода параметров нажмите кнопку Сканировать станут доступны.
6. Выберите кнопку Сканировать для выполнения подсчета коробки проверки на выбранное изображение.
   Примечание: Проверка будет генерировать три окна с выходы данных: корпуса и круг результаты, файл резюме Box игр и проверка типов. Окно сканирования типов содержит журнал настройки, используемые, а также стандартные отклонения для определенных мер. Для целей настоящего Протокола в окно проверки типов не используется и может закрыты или сохранить для будущей справки.
7. В окне Халл и Круг результатов скопировать все нужные данные (т.е., плотность, span соотношение и округлость) результаты. В окне Поле Count Summary , скопируйте нужные данные (т.е., фрактальная размерность и лакунарности) результаты. Перенесите скопированные данные в файл Excel или статистического программного обеспечения.
   Примечание: Полный перечень FracLac выходные данные предоставляются и тщательно разъясняется в FracLac для ручной ImageJ¹⁶.

Discussion

Микроглии клеток тонко настроены на физиологии и патологии в пределах их микро доменов и отображать широкий спектр морфологии² тонкие^7,14 и грубой травмы⁸. Использование протоколов ImageJ делает количественной морфологии микроглии доступным для всех лабораторий в качестве платформы и плагины являются открытым исходным кодом обработки изображений программное обеспечение. Хотя описанные протокол ориентирована на анализ с использованием этого программного обеспечения и обработки изображений, согласованности сбора данных, достоверности и надежности начинается с отличным IHC и микроскопии. Этот протокол используется для улучшения двоичный, скелет и наброски представления всей микрофотографиями и отдельные ячейки, но не может занять место бедных IHC окрашивание и микроскопии, что приводит к низкой контрастности, размыты или искаженные изображения. Как дополнительного рассмотрения должны позаботиться не придавить ткани мозга во время хранения, до секционирование, которая безвозвратно изменяет микроглии морфологии. И наконец в рамках каждого эксперимента, быть imaged микроглии с использованием той же шкале, а так же микроскопа. Приборостроение, цели и программное обеспечение различаются среди Микроскопы, которые приведет к различных размеров микрофотографиями, несмотря на схожие цели и изменить детали, а также количество клеток в каждом кадре. Например получение изображения с помощью 40 X цель на Leica SPII результаты в два раза числа клеток и менее подробно, чем приобретение с помощью Zeiss 880. Это особенно важно для ячейки ветвления данных, собранных из всего кадра, а не одну ячейку, как это становится проблемой выборки данных.

В общем скелет анализ, который использует весь Микрофотография предшествует одноклеточного Фрактальный анализ по двум причинам. Определяющим ветвления клеток всех ячеек в Микрофотография является быстрым, по сравнению с одной ячейке Фрактальный анализ и может рассматриваться как инструмент скрининга, если время является фактором. Кроме того двоичных изображений, полученных в ходе скелет анализа используются для фрактального анализа. После записи образа, существует ряд важных шагов, которые могут повлиять на результаты анализа скелета и ввести пользователя влияние. Протокол шаги, которые большинство переменной между пользователями являются шагом 4.2 (увеличение яркости изображения) и шаг 4.5 (определение порога). Там, где это возможно, оптимального числа для увеличения яркости (max или min ползунок между 0-255) определяется и удерживается в постоянном для всех изображений и пользователей. Где изображение изменчивость велик, пользователь может вместо этого выбрать яркость, которая будет варьироваться между изображениями. В качестве альтернативы, если изображения ярких и высокий контраст, затем увеличение яркости может быть опущен и порог может быть стандартизирована с помощью фильтра порог специальность (например., Хуан) вместо более переменной по умолчанию. После того, как оптимизированы, параметры следует придерживаться для того, чтобы свести к минимуму влияния дополнительных пользователей.

Пример пользовательского изменчивости представлен на рисунке 5. Значения данных были увеличены в User 1 против 2 пользователя и поэтому изменчивость будет увеличено, если пользователь 1 и пользователь 2 способствовали сбору данных. Пример различий в пользователь 1 и пользователь 2 бинарных и каркасный изображения выделяются цветные круги (Рисунок 5). В этом случае оба пользователи были кратко подготовленных студентов с ограниченным опытом в микроглии. Регулярного надзора и наставничества микроглии экспертов наряду с повышенной протокол подготовки² может снизить изменчивость между пользователем. Хотя здесь не оценены, Фрактальный анализ является менее подвержен изменчивость между пользователем потому что бинарные клетки вручную и индивидуально изолирован от Микрофотография вместо того, чтобы полагаться исключительно на порог для определения микроглии фигур. Однако все методы обладают некоторые изменчивость между пользователями. Таким образом, один пользователь (в идеале, подготовленных некоторый опыт в Микроглии клеток) должна завершить сбор данных для всего набора данных.

Дополнительные изменения можно легко внести этот протокол и будет зависеть от качества изображения и усилия, предпринятые для уменьшения шума и обеспечить процесс подключения. Например если контраст, затем маска нерезкости не является необходимым и может быть опущен. Это разумно, чтобы оптимизировать и завершить подготовку протокола для определенного набора изображений, экспериментальных дел и управления, до сбора данных из всего набора. И наконец, дополнительные плагины могут использоваться вместо других уточнить или резкость изображения, которые не были описаны в настоящем протоколе такие как расширяются или резкость.

Преимуществами этого протокола являются всеобщей доступности и адаптируемость. Кроме того оценки клеток ветвления с помощью AnalyzeSkeleton быстро и применимых к весь Микрофотография. Преимущество нескольких ячеек анализ подхода является фокус на весь регион, а не на отдельные клетки. Таким образом это позволяет быстро оценить средний ветвления (с точки зрения конечных точек и процесс длина) всех микроглии в пределах изображения. Скелет анализ представляет собой анализ нескольких ячеек: выборка данных с точки зрения числа клеток, которые не могут быть подкреплены Фрактальный анализ из-за инвестиций требуется время для изоляции единичных клеток от микрофотографиями. Экземпляр, где это может быть наилучшим будет скрининга микроглии морфологии в proximities фокуса травмы. Одно ограничение — это несовершенной, когда по сравнению с подходом больше времени одну ячейку поля целиком рендеринга изображений для создания скелета моделей IHC микрофотографиями. Кроме того анализ региона не соответствующие обстоятельства, когда Микроглия морфологии резко отличаются в пределах той же области. Наконец этот метод анализа зависит число ячеек, параметр, который может отличаться между экспериментальных условиях.

Фрактальный анализ проводится на одну ячейку и поэтому дополняет результате скелет анализа выходных данных ветвления средний клеток. Хотя гораздо больше времени, эта инвестиция дает широкий спектр морфометрических данных. Например, ячейка плотность, span отношение, и округлость данных описывают размер, удлинение и форму контура ячейки, соответственно. Фрактальная размерность и лакунарности суммировать ячейки сложности и формы неоднородность, соответственно. Более глубокое изложение как рассчитывается каждый параметр и интерпретации данных приводится в интерактивной ручной¹⁶ и такая деталь следует рассматривать в связи с вопросом конкретных исследований. Результаты описанных протокол в чувствительных инструментов для количественного определения небольшие изменения в 2D микроглии морфологии, которые могут произойти в условиях физиологического и патологического. Дополнительные морфометрический анализ прочности, выпуклости и форма фактор^16,20 может быть возможным, если создание 3D-фигур.

Разработка протокола и адаптация непрерывной и ориентированные на пользователя. Он был продлен с флуоресцентным⁸ DAB/ярко поле изображения⁷ , но еще не парафин встроенных ткани. Это Кроме того, он может использоваться в сочетании с патентованного программного обеспечения, такие как Imaris для дополнительного анализа. Этот протокол может применяться к различным физиологии и не ограничивается микроглии, но может быть применен к любой клетки или ткани с конкретной модели или формы, которые могут быть идентифицированы с помощью методов IHC. Наконец с достаточным размером выборки, кластер или многовариантный анализ может быть применен к стратифицировать микроглии по морфологии^12,21; Это значимой информации как морфология микроглии является жизненно важным показателем микроглии функций и ответы на их окружение. Признательность за микроглии морфологической разнообразия расширяющейся и важно полностью понимать нейрон глии сосудистой взаимодействий во время болезни и здоровья. Рост в этой области усиливается развитая, простой в использовании и воспроизводимые протоколы для количественной оценки и обобщения микроглии морфологии, используя несколько непрерывной переменных.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
primary antibody anti-IBA1	Wako	019-19741	rabbit host
Vectashield soft mount	Vector Labs	H-1000
Secondary antibody	Jackson ImmunorResearch	711-545-152	donkey host
4 mL glass vial	Wheaton	UX-08923-11
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S-8032
glass coverslip	Fisher Scientific	12-544-G