המחברים תודה פאלמר, ה באבו (סטנפורד נוירוכירורגיה) למתן מאתר באמנות NPCs. וקטור באיור 4 בשימוש ומותאמים מאמנות רפואי שרת תחת יצירתי של מלאי ייחוס 3.0 רישיון (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). חלק מעבודה זו בוצעה ב סטנפורד ננו משותפים מתקנים (SNSF), הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מרכזים לגיל הרך-1542152. N.A.S. מאשר תמיכה מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים (32GM 008412). ובין מאשר תמיכה של NRSA NIH מראש דוקטורט (F31 EB020502), חוקרים לגשת לתוכנית של Siebel. S.C.H. מאשר תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (U19 AI116484 ו- R21 EB018407), הקרן הלאומית למדע (DMR 1508006), מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (RT3-07948). מחקר זה קיבל מימון הברית עבור הדרכה (AR3T), ומחקר השיקום רגנרטיבית נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) ו המכון הלאומי של הדמיה ביו, בביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. לשכנו ביטוי בפרוטוקול
<ol><li>יום 1: גידול המושבה starter
	<ol>
<li>להכין פלטות אגר אמפיצילין, כלורמפניקול מאת autoclaving 25 גר' לוריא ציר 15 גרם של אגר לכל 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. ברגע הפתרון הוא מקורר עד ~ 60 ° C, להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) ו- 1 מ"ל כלורמפניקול מניות (34 ?...

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension.">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+(3D)+culture+systems.">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays.">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling.">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).</li><li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling.">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li><li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs:+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation.">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li><li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth.">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li><li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface.">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering.">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+(ELPs)+with+variable+guest+residues.">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li><li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Topographic+Imaging+of+Environmentally+Responsive,+Elastin-Mimetic+Hydrogels.">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li><li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+Elastin-Mimetic+Protein+Gels+Derived+from+a+Well-Defined+Polypeptide+Precursor.">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li><li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrakis(hydroxymethyl)+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels.">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li><li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth.">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li><li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles.">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li><li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels.">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li><li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+(ELP-HA)+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration.">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li><li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Orthogonally+Crosslinked,+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation.">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li><li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides.">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li><li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+tuning+of+multiple+biomaterial+properties+using+protein+engineering.">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems.">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li><li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment,+Migration,+and+Neurite+Outgrowth.">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li></ol>

ביטוי חלבון רקומביננטי טיהור הוא כלי רב עוצמה כדי לסנתז biomaterials עם הפארמצבטית גבוהה. בעיקר בשל כניסתו של שיבוט מולקולרי ממוסחר, פלסמידים רקומביננטי מותאם אישית ניתן לרכוש מהספקים מספר, אשר מפחית באופן משמעותי את הזמן כדי לעבוד עם חומרים כמו ELPs. באופן דומה, ניתן לבקש פלסמידים ישירות מן המעב?...

במהלך המאה האחרונה, מימדי תרביות רקמה (2D) התפתחה כלים אינטגרלי ללמוד תא יסוד ביולוגיה במבחנה. בנוסף, הפרוטוקולים יחסית נמוכים ופשוטים לקבלת תרבית תאים 2D הובילו האימוץ שלה על פני תחומים רבים ביולוגי ורפואי. עם זאת, מחקרים שנעשו בעבר הראו כי פלטפורמות 2D מסורתי עשוי להוביל לתוצאות כי לסטות בצורה ניכרת האלה שנאספו ויוו, גורם זמן יקר ומימון מבוזבז עבור מחקר קליני מונחה1,2, 3. אנחנו ואחרים משערים כי אי-התאמה זו לייחס חוסר רמזים הביוכימי, biophysical יליד מסופקים על התאים תרבותי על משטחים 2D, אשר יכול להיות הכרחי עבור הפצת אופטימלית, ההבשלה של סוגי תאים שונים.
כדי לטפל אלה גשר מגבלות ולעזור הפער בין 2D מחקרים במבחנה , ויוו , חוקרים יש פלטפורמות מפותחת הידרוג תלת מימדי (3D) התא-כימוס1,4,5 ,6. Hydrogels הם חומרים אידיאלי כדי לסכם את microenvironment אנדוגני של ה מטריצה חוץ-תאית (ECM) ויוו עקב שלהם תכונות מכניות רקמה דמוית ומבנה נפוחות-מים המאפשרת מעבר מהיר של חומרים מזינים, איתות גורמים7,8. יתר על כן, 3D hydrogels ניתן לעצב יש שליטה עצמאית על מאפייני מכני וביוכימי לגרדום. מטריקס מכניקה9,10,11,12 והן תא-דבק ליגנדים13,14,15 ידועים להשפיע על התא התנהגות במבחנה , ויוו. לפיכך, hydrogels 3D עם מאפיינים tunable מציעים פלטפורמה כדי לחקור את היחסים סיבתי בין תאים microenvironment שלהם. קריטריונים עבור מטריצה הידרוג 3D אידיאלי כוללים תא פשוט, שאינו-ציטוטוקסיות-כימוס, כמו גם tunability עצמאית של תכונות מכניות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מחקה של מוטיבים תא-דבק מקורית.
שניהם סינתטיים (למשל., פוליאתילן גליקול, חומצה polylactic, פוליפוני (חומצה גליקולית)), נגזר באופן טבעי (למשל., alginate, קולגן, Matrigel) hydrogels יש יתרונות על פני 2D in vitro לקשרי תרבות פלטפורמות; עם זאת, יש להם גם חסרונות משמעותיים אשר להגביל את התחולה שלהם. הראשון, פלטפורמות רבות סינטתיים, נגזר באופן טבעי לדרוש תנאים קשים crosslinking יכול להיות רעיל לתאים בתרבית של, מה שהוביל ירדה תא הכדאיות7. בנוסף, פלטפורמות סינתטיים רבים חוסר אתריים מקורית ויש צורך להיות functionalized דרך משני תגובות כימיות, אשר יכול להוסיף את העלות והמורכבות מוגברת16. לבסוף, בעוד חומרים באופן טבעי-derived מכילים בדרך כלל מהותי בתחומים ביו-אקטיביות, הם לעיתים קרובות מוטרדים על ידי השתנות אצווה-כדי-אצווה גבוהה, לעיתים קרובות מוגבלות ויוצרים ג'לים חלשה יחסית7,17.
חלבון רקומביננטי הנדסה מציג ערכת כלים ייחודיים לעיצוב חומרים על-ידי מתן שליטה מפורשת על חלבון רצף, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני הידרוג הסופי לגרדום18. בנוסף, באמצעות מינוף המנגנון הביולוגי הידוע של Escherichia coli (e. coli) לבטא חלבונים, חומרים יכול להיות מיוצר באופן חסכוני ועקבי עם השתנות מוגבל אינטר - ו אינטרה-אצווה. החלבון כמו אלסטין (ELP) המוצג כאן יש שלושה תחומים מהונדסים: (1) T7 ו His6 תג מאפשר תיוג ויה fluorescently מתויג נוגדנים, (2) אזור 'אלסטין דמוי' מקנה תכונות מכניות אלסטית ומאפשרת עבור חומר כימי crosslinking, ו- (3) אזור 'ביו-אקטיבי' מקודד עבור התא-דבק מוטיבים.
באזורנו אלסטין דמוי מבוסס על רצף הקנוני של אלסטין5 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) שבו ארבעה מתוך 'Xaa' חומצת אמינו באתרים איזולאוצין (Ile), אבל יכול להיות מתוכנן להיות כל חומצה אמינית פרט פרולין. רצף זה מעניק ELPs רקומביננטי עם התחתון התנהגות טמפרטורה (LCST) פתרון קריטי שעלולים להיות מנוצלים לרעה לביטוי שלאחר טיהור פשוטה באמצעות תרמית רכיבה על אופניים19,20. בית מלון LCST זה ניתן לכוונן אותו תרמית צבירה בטמפרטורות שונות על-ידי שינוי של חוות 'Xaa' שאריות21,22.
כאן, עמדה 'Xaa' על אחד חוזר כמו אלסטין חמש הוחלף את הצגת amine ליזין (Lys) חומצת אמינו, אשר מנוצל עבור הידרוג crosslinking. העבודות הקודמות שלנו הראו crosslinking הלא-ציטוטוקסיות וחזק באמצעות תגובה עם כלוריד (THPC)23phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) crosslinker אמין-ריאקטיבי. מאת בדרגות שונות הכוללת חלבון התוכן crosslinker ריכוז, אנו מסוגלים לייצר hydrogels זה ניתן לכוונן אותו span של נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית טווח (~0.5-50 kPa)9,23,24. בנוסף כוונון תכונות מכניות, התא אדהזיה בתוצאות הידרוג מן השילוב של תחומים תא-דבק קאנונית בתוך עמוד השדרה של החלבון אמרסון, לייק ופאלמר. לדוגמה, שילוב של מורחבים נגזר fibronectin 'RGDS' חומצת אמינו הרצף מאפשר תא הידבקות וגמישות הסתגלותי, ואילו מקושקשות, מחייב 'RDGS' משתנה מגבילה את תא-מטריקס אדהזיה24. מאת להתכוונן על היחס של התא-דבק חלבונים ללא דבק, כמו גם ריכוז החלבון הכולל, אנו מסוגלים לייצר ביעילות hydrogels שיימתחו מגוון רחב של ליגנד ריכוז. . Resultantly, פיתחנו פלטפורמה הידרוג עם decoupled נכסים הביוכימי, biophysical, אשר ניתן לכוונן באופן עצמאי לתרבות 3D אופטימלית של סוגי תאים שונים.
בנוסף נוקשות מטריקס וליגנד דבק tunability, hydrogels רקומביננטי מציעים את היכולת פרופילים ספציפיים השפלה גשמי עיצוב, אשר הכרחי תא התפשטות, התפשטות של הגירה בתוך ההקשר 3D4 , 9. את ההשפלה הזו המוענקת על ידי הפרשת תא פרוטאזות שמתמקדים 'RGDS' מורחבת9 או רצף אלסטין דמוי25. אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels יש גם הוכח כדי לתמוך את מבחני הביוכימי עוקבות הדרושים ללימוד תא הכדאיות ותפקוד כולל immunocytochemistry, כמו גם מיצוי DNA/RNA/חלבון עבור הפוכה כמותיים תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) והמערבית כתם9. אמרסון, לייק ופאלמר משתנים גם השתמשו במספר דגמים ויוו , ידועים להיות נסבל היטב על ידי המערכת החיסונית26.
יחדיו, אמרסון, לייק ופאלמר כמו פלטפורמה גשמי ללימודי תא-כימוס מציע מגוון רחב של יתרונות בהשוואה פלטפורמות חומרים סינתטיים או נגזר באופן טבעי, אשר לעתים קרובות חוסר באותה מידה של tunability הביוכימי, הביו-פיסיקלי ו הפארמצבטית. בנוסף, פשוטה-ציטוטוקסיות לשימוש של אמרסון, לייק ופאלמר עם מגוון רחב של סוגי תאים (למשל., צ'יק העזוב שורש הגרעינים14,24, מאתר קדמון עצבית תאים9,27, שור תאי גזע אנושי mesenchymal neonatal chondrocytes28, האדם אנדותל תאים29,30) מאפשר מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של ECM 3D אנדוגני בהשוואה תרבית תאים 2D. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly, ELPs לשימוש כפלטפורמה הידרוג tunable 3D תא אנקפסולציה. בהמשך נציג את המתודולוגיה תיוג פלורסנט למטה-stream, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים שעברו אנקפסולציה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

טכניקות מימדי תרביות רקמה (2D) היה חיוני להבנת ביולוגיה של התא הבסיסי. עם זאת, היעדר מערכות התרבות המסורתית של רקמות 2D מטריצה תלת מימדי (3D), וכתוצאה מכך משמעותי נתק בין תוצאות נאסף במבחנה ו vivo בתוך. כדי לטפל מגבלה זו, החוקרים היה לתכנן פלטפורמות תרביות רקמה הידרוג תלת-ממד שיכולים לחקות את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של microenvironment תא ויוו . מחקר זה הניעה את הצורך לפתח פלטפורמות גשמי התומכים תא 3D כימוס של מבחני הביוכימי במורד הזרם. חלבון רקומביננטי הנדסה מציעה ערכת כלים ייחודיים הידרוג תלת-ממד גשמי עיצוב ופיתוח על-ידי מתן שליטה מסוימת של חלבון רצף ולכן, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני תוצאות מטריקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly אלסטין, כמו חלבון (ELP), אשר יכול לשמש כדי hydrogels טופס עם תכונות מכניות באופן עצמאי tunable וריכוז ליגנד תא-דבק. בהמשך אנו מציגים מתודולוגיה תא אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels ומוטבעים מכתים immunofluorescent עוקבות של תאים עבור ניתוח במורד הזרם כמת.

ELPs בשימוש פרוטוקול זה המורכב מעובדים חמישה אזורים: תג T7 His6 תג, אתר פצילות enterokinase (EK), אזור ביו-אקטיביות, אזור כמו אלסטין (איור 1). T7 ותגי His6 מאפשרים זיהוי קל באמצעות טכניקות תספיג סטנדרטי. מבוא של אתר המחשוף EK מאפשר הסרת אנזימטי של האזור תג, במידת הצורך. האזור ב...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D at JoVE.com

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

The overall goal of this protocol is to express and purify recombinantly derived elastin-like proteins for use as a tunable hydrogel for 3D cell encapsulation. Additionally, this protocol presents the methodology for downstream fluorescent labeling in confocal microscopy of encapsulated cells. This method can help answer key questions within the fields of biomaterials, regenerative medicine, and cell biology, such as understanding the role of cell-extracellular matrix interactions in 3D.The main advantage of this technique is that it provides a reproducible, tunable, and modular material platform that is amenable to the study of multiple cell types. Overall, the implementation of this technique can improve our understanding of the critical cell ECM signaling parameters that may dictate the success of future cell-based regenerative therapies. Streak an ampicillin and chloramphenicol agar plate with a premade bacterial stock containing a vector that encodes for the ELP of interest.Then incubate the streaked plate upside down at 37 degrees Celsius overnight to allow for bacterial growth. The following day, pick a single colony from the plate and inoculate the prewarmed starter culture. Incubate the culture in a shaker at 37 degrees Celsius for 16 hours.After the incubation period, use a serological pipette to transfer 20 milliliters of the starter culture to each expression flask. Leave the expression flask shaking for one hour. After one hour, measure the optical density at 600 nanometers of an aliquot from the expression flask.As soon as the reading reaches 0.6, reduce the temperature of the shaker to 32 degrees Celsius. When the reading reaches 0.8, add one milliliter of one molar sterile filtered IPTG to induce ELP expression in the expression flask. Allow the culture to express for seven hours.After seven hours, centrifuge the expression media at 12, 000 x g for 15 minutes at four degrees Celsius in a floor centrifuge. After the centrifugation, use a spatula to collect the cell pellet from the centrifuge container and place into a preweighed ziploc bag. Next, dissolve the cell pellet in sterile filtered TEN buffer.Massage the cell pellet to form a homogenous solution. Freeze the ziploc bag with resuspended cell pellet in a secondary container at 80 degrees Celsius. To the thawed cell pellet, add approximately 30 to 40 milligrams of deoxyribonuclease and one milliliter of 100 millimolar PMSF for every 100 milliliters of cell lysate.Incubate the lysate at four degrees Celsius on a shaker overnight. Following the third freeze-thaw cycle, centrifuge the samples at at least 15, 000 x g for one hour at four degrees Celsius. Post centrifugation, pour off the supernatant from the centrifuge container and transfer the solution to a new centrifuge container.To every 100 milliliters of supernatant, add 5.84 grams of sodium chloride in three parts to a final one molar concentration. Incubate the suspension in a shaking incubator at 37 degrees Celsius for three hours. Following the incubation, centrifuge the samples at at least 15, 000 x g for one hour at 37 degrees Celsius.Post centrifugation, discard the supernatant from the centrifuge container and mass the pellet. Next, add 10 milliliters of autoclaved ultrapure water per gram of pellet obtained after centrifugation. To ensure that the protein dissolves completely, use a metal spatula to mash and resuspend the pellet.Incubate the resuspended pellet at four degrees Celsius overnight on an orbital shaker. Repeat the cold and hot centrifugation steps for a total of three cycles to further purify the ELP. Next, dialize the residual supernatant in a 3.5 kilodalton dialysis membrane against four liters of prechilled ultrapure water at four degrees Celsius for three days to desalt the protein solution.Centrifuge the final dialyzed solution in a precooled centrifuge. Freeze the supernatant at 80 degrees Celsius in a preweighed conical tube. Finally, lyophilize the frozen solution for three days and then weigh the final lyophilized product to determine protein yield.With the help of a biopsy punch, create holes in a 0.5 millimeter thick silicone sheet. Then cut a square around each hole. Next, use tweezers to remove the plastic wrap on each side of the individual molds.After removing the plastic wrap, use the tweezers to position the identical number of bare silicone molds and glass cover slips in alternating rows on the lid of a 48 well plate for subsequent plasma bonding. After all cell culture materials have been fabricated, the preparation of the cell type of interest for downstream hydrogel encapsulation may begin. After dissociating the cells into a single cell suspension, aliquot the desired number of cells into a 1.5 milliliter centrifuge tube.Then, centrifuge the cells at approximately 200 x g for three minutes. Post centrifugation, aspirate the supernatant and store the pellet on ice. Resuspend the cell pellet in ELP stock solution to 80%of the final volume.Then use a pipette to mix the solution into a homogenous suspension of cells in ELP. For the remaining 20%final volume, add THPC stock solution to the cell ELP suspension. Pipette several times to ensure the formation of a homogenous mixture, while avoiding the formation of air bubbles.Next, in a circular motion, pipette the cell ELP THPC mixture into each mold in a 24 well plate. Then incubate the samples at room temperature for 15 minutes. After 15 minutes, incubate the samples at 37 degrees Celsius for an additional 15 minutes.Once the incubation is over, carefully add 750 microliters of warm cell culture medium to each well in a 24 well plate. Leave the hydrogel at 37 degrees Celsius for the desired culture duration. First, aspirate the medium from each well.Then wash the wells with one milliliter of warm DPBS. After washing is completed, add 750 microliters of fixation solution to each well. Then, incubate the 24 well plate at 37 degrees Celsius for 30 minutes.After the incubation, aspirate the fixation solution from each of the wells and discard the fixative in a hazardous waste container. Next, add one milliliter of DPBS to the sample and immediately discard the DPBS into a hazardous waste container. Next, add 750 microliters of permeabilization solution to permeabilize the sample for one hour at room temperature on the rocker at 15 revolutions per minute.After one hour, aspirate the permeabilization solution and add 750 microliters of blocking solution to the sample. Leave the sample on the rocker at room temperature for three hours. Then dilute the desired primary antibodies with the antibody dilution solution.Next, add 500 microliters of the antibody solution to each sample. Incubate the samples overnight at four degrees Celsius. The following day, aspirate the primary antibody solution, then wash the samples with PBST for one hour thrice at room temperature at 15 revolutions per minute.Next, dilute the appropriate secondary antibodies in five milligrams per milliliter of DAPI stock solution to achieve a final concentration of 2.5 micrograms per milliliter. Then, add 500 microliters of the solution to each sample. Next, use aluminum foil to cover the 24 well plate and incubate the plate at four degrees Celsius overnight.The next day, aspirate the secondary antibody solution and wash the samples with PBST thrice each for 30 minutes at room temperature on a rocker. Next, position a drop of hardset mounting medium on the surface of a glass slide and place the sample on the mounting medium. Finally, use nail polish to seal the samples to the glass cover slide to prevent contamination or sample movement.Here, expression of the target protein with the full length ELP under controlled conditions is validated by the presence of bands at 37 kilodaltons in both SDS-PAGE and western blot analysis. However, under uncontrolled conditions, several low molecular weight bands are also visible using western blot. The lower molecular weight bands correspond to proteins with less than four elastin-like domain repeats, indicating that the protein is not fully translated during expression.This result is common when conducting the expression above 32 degrees Celsius. To vary the cell adhesive ligand concentration while keeping the hydrogel mechanical properties constant, the ratio of ELP variant containing the fibronectin-derived cell adhesive and the non-cell adhesive sequences are tuned. Further, murine neural progenitor cells are also viable over a period of seven days when encapsulated in a 3%ELP hydrogel.The live cells are identified in green due to the calcein AM stain, whereas the red ethidium homodimer is preferentially taken up by the dead cells. To validate the stem cell phenotype of neural progenitor cells, expression of canonical markers such as Sox2 and nestin are also visualized by immunostaining when the cells are encapsulated in the 3D ELP hydrogels. After watching this video, you should have a good understanding of how to express and purify elastin-like protein for downstream encapsulation of various cell types, and in addition, investigate the role of the 3D microenvironment in modulating cellular phenotype.