Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

Zusammenfassung

Lebenden Organismen müssen regelmäßig mit wechselnden Umgebungen während ihres gesamten Lebenszyklus, einschließlich Änderungen der Temperatur, pH-Wert und die Anhäufung von reaktiven Sauerstoffspezies zu bewältigen. Diese Schwankungen können führen zu einem weit verbreiteten Protein entfaltet, Aggregation und Zelltod. Daher haben Zellen ein dynamisches und Stress-spezifische Netzwerk von molekularen Chaperone entwickelt, die eine "gesunde" Proteom während Stress-Bedingungen zu gewährleisten. ATP-unabhängige Chaperone bilden eine große Klasse von molekularen Chaperone, die als erste Verteidigungslinie Moleküle, Schutz gegen Proteinaggregation in einer Stress-abhängigen Weise dienen. Eine Eigenschaft, die diese Chaperone gemeinsam haben ist ihre Fähigkeit, Strukturelle Plastizität für ihre Stress-spezifische Aktivierung, die Anerkennung und die Freisetzung von fehlgefaltete Client zu nutzen.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die funktionelle und strukturelle Analyse von einem solchen intrinsisch ungeordneten Chaperon, die bakterielle Redox-regulierten Hsp33, die Proteine gegen Aggregation bei oxidativem Stress schützt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Instrumentarium der verschiedenen Techniken für die Untersuchung von Redox-regulierten Chaperon Aktivität sowie für die Zuordnung von Konformationsänderungen das Chaperon seine Tätigkeit zugrunde liegt. Im einzelnen beschreiben wir einen Workflow umfasst die Vorbereitung der vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteine, gefolgt von einer Analyse des Chaperon Anti-Aggregation Aktivität in Vitro mit lichtstreuenden, mit Schwerpunkt auf den Grad der die Anti-Aggregation-Aktivität und die Kinetik. Um häufige Ausreißer während der Aggregation Assays zu überwinden, beschreiben wir die Verwendung von Kfits, ein neuartiges grafisches Tool die einfache Verarbeitung der kinetische Messungen ermöglicht. Dieses Tool kann leicht auf andere Arten von kinetische Messungen zum Entfernen von Ausreißern und Montage kinetische Parameter angewendet werden. Um die Funktion mit der Proteinstruktur korrelieren, beschreiben wir die Einrichtung und den Workflow einer strukturellen Massenspektrometrie-Technik, Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie, die die Zuordnung von Konformationsänderungen auf das Chaperon ermöglicht und Substrat in verschiedenen Phasen der Hsp33 Aktivität. Dieselbe Methode kann auf andere Protein-Protein und Protein-Ligand-Interaktionen angewendet werden.

Einleitung

Zellen haben häufig eine Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produziert als Nebenprodukte der Atmung1,2, Protein und Lipid Oxidation3,4und zusatzprozesse5, 6,7. Trotz ROS positive Rolle im vielfältigen biologischen Prozessen wie Mobilfunk Signalisierung8,9 und Immunantwort10auftreten ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und die Entgiftung, führen zu oxidativen betonen Sie7. Die biologische Ziele von ROS sind Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die Oxidation von denen beeinflussen, ihrer Struktur und Funktion. Daher ist die Anhäufung von zellulären Oxidantien stark an ein breites Spektrum von Krankheiten einschließlich Krebs9,11, Entzündung12,13und Altern14, gebunden. 15, und habe bei der Entstehung und Progression von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und ALS Krankheit16,17,18einbezogen werden.

Neu synthetisierten und Reifen Proteine sind sehr anfällig für Oxidation durch die potenziell schädlichen Änderungen ihrer Seitenketten, die Protein-Struktur und Funktion19,20prägen. Oxidativer Stress führt daher meist zu eine weit verbreitete Protein Inaktivierung, Fehlfaltung und Aggregation, was schließlich zum Zelltod. Eines der eleganten zellulären Strategien zur Bewältigung des potenziellen Schadens der Protein-Oxidation ist Redox-abhängige Chaperone, zu verwenden, die die weit verbreitete Proteinaggregation, statt zu bilden stabile komplexe mit Client fehlgefaltete Proteine21 hemmen ,22,23. Diese erste Verteidigungslinie Chaperone sind schnell durch eine ortsspezifische Oxidation (in der Regel auf Cystein Rückstände) aktiviert, die sie potente anti-Aggregation Moleküle24umwandelt. Da oxidativer Stress in der Hemmung der Atmung und sinkt in der zellulären ATP Niveaus25führt, sind kanonische ATP-abhängige Chaperone weniger wirksam bei oxidativem Stress Bedingungen25,26 ,27. Redox-aktivierte ATP-unabhängige Chaperone spielen daher eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein auf die Anhäufung von Oxidantien in Bakterien und Eukaryoten (z.B., Hsp3328 und RidA29 in Bakterien, Get330 in der Hefe, Peroxiredoxins31 in den Eukaryotes). Die Aktivität der diese Chaperone hängt stark von reversible strukturelle Konformationsänderungen induziert durch eine ortsspezifische Oxidation, die hydrophobe Regionen an der Anerkennung der Client fehlgefaltete Proteine beteiligt deckt.

Forschung von der Anti-Aggregation-Mechanismus und die Grundsätze für die Anerkennung der Client Proteine durch Chaperone ist nicht einfach aufgrund der dynamischen und heterogene Charakter der Chaperon-Substrat Interaktionen32,33, 34,35,36,37. Stress-regulierten Chaperone haben jedoch die Möglichkeit, unser Verständnis von der Anti-Aggregationsfunktion aufgrund ihrer Fähigkeit,: 1) zwei verschiedene Formen der Chaperon (z.B.oxidiert) aktiv und inaktiv (z. B.zu erhalten (reduziert), bei der Einführung oder Entfernung einer Stress-Bedingung, die einfache Umschaltung zwischen ihnen (z.B., Oxidationsmittel und Reduktionsmittel), 2) verfügen über eine breite Palette von Substraten, 3) bilden sehr stabile komplexe mit den Client-Proteinen, die durch ausgewertet werden können verschiedenen strukturellen Methoden, und 4) konzentrieren sich ausschließlich auf das Substrat Anerkennung und Freigabe, vermittelt durch Konformationsänderungen Redox-abhängige, da der Großteil dieser Chaperone die Faltung Fähigkeit fehlt.

Hier analysieren wir die bakterielle Redox-regulierten Chaperon Hsp33 Anti-Aggregation Aktivität, ein wesentlicher Bestandteil des bakteriellen Verteidigungssystems gegen Oxidation-induzierte Protein Aggregation28. Wenn reduziert, ist Hsp33 ein dicht gefaltet Zink-bindendes Protein ohne Chaperon-Aktivität; jedoch beim oxidativen Stress ausgesetzt, durchläuft Hsp33 umfangreiche Konformationsänderungen die seine Substrat Bindung Regionen38,39aussetzen. Bei der Oxidation ist die Zink-Ionen, die stark an vier hoch konservierten Cystein-Reste von der C-terminalen Domäne gebunden ist freigegeben40. Dies führt zur Bildung von zwei Disulfid-Bindungen, eine Entfaltung der C-terminalen Domäne und eine Destabilisierung des angrenzenden Linker Region41. Die C-terminale und Linker Regionen sind sehr flexibel und sind definiert als intrinsisch oder teilweise ungeordnet. Nach Rückkehr nach non-Stress-Bedingungen die Cysteine werden reduziert und das Chaperon wieder auf native zusammengeklapptem Zustand ohne Anti-Aggregation-Aktivität. Die umfaltung der Chaperon führt zu einer weiteren Entfaltung und Destabilisierung des Proteins gebundenen Kunden, die ihre Übergabe an die kanonische Chaperon-System DnaK/J, umfaltung38auslöst. Analyse der Hsp33s Interaktion Seiten legt nahe, dass Hsp33 verwendet beide, die Regionen sowie die hydrophoben Regionen auf Linker und N-terminale Domäne erfassen ihrer geladenen ungeordneten Proteine Client misfolded und verhindern deren Aggregation38, 42. im zusammengeklappten Zustand sind diese Regionen durch die gefalteten Linker und C-terminale Domäne versteckt. Interessant ist, dient die Linker-Region als Gatekeeper der Hsp33s gefalteten und inaktiven Zustand, den klappbaren Status seiner benachbarten C-terminale Domäne34"sensing". Sobald durch Mutagenese (entweder durch eine Punktmutation oder eine vollständige Sequenz Störung) destabilisiert, wird Hsp33 in ein konstitutiv aktiv Chaperon unabhängig Redox Bundesstaat seine Redox-Sensitive Cysteine43konvertiert.

Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen Überwachung der Redox-abhängige Chaperone Aktivität Hsp33s sowie Zuordnung Konformationsänderungen auf die Aktivierung und Bindung von Kunden Proteine. Diese Methodik kann andere Chaperon-Client Anerkennung Modelle als auch nicht-Chaperon-Protein-Protein-Wechselwirkungen Forschung angepasst werden. Darüber hinaus präsentieren wir Protokolle für die Zubereitung von vollständig reduzierte und oxidierte Chaperone, die in den Studien von anderen Proteinen Redox-Schalter verwendet werden können, um mögliche Rollen der Protein-Oxidation auf die proteinaktivität zu offenbaren.

Im einzelnen beschreiben wir ein Verfahren zur Überwachung Chaperon Aktivität in Vitro und definieren die Substratspezifität unter verschiedenen Arten von Proteinaggregation (chemisch oder thermisch induzierte) mit Lichtstreuung (LS) gemessen an einem Fluorospectrometer44. Während der Anhäufung Licht Streuung bei 360 nm erhöht sich rasch durch die zunehmende Trübung. Somit kann Aggregation in einer zeitabhängigen Weise bei dieser Wellenlänge überwacht werden. LS ist eine schnelle und empfindliche Methode zum Testen von Proteinaggregation und somit die Anti-Aggregation-Aktivität eines Proteins des Interesses mit nanomolaren Konzentrationen, sodass die Charakterisierung von Protein Aggregation-kinetische Parameter unter verschiedenen Bedingungen. Darüber hinaus das hier beschriebene LS-Protokoll erfordert keine teuren Instrumentierung und kann problemlos in jedem Labor hergestellt werden.

Dennoch ist es ziemlich schwierig, "saubere" kinetischen Kurven zu erhalten und solche Lichtstreuung Experimente, wegen Lärm und die große Zahl der Ausreißer von Luftblasen und großen Aggregaten erzeugt ein Protein kinetische Parameter abgeleitet. Um dieses Hindernis zu überwinden, präsentieren wir ein neues grafisches Tool, Kfits45, für Lärmbelastung in verschiedene kinetische Messungen, speziell ausgestattet für Protein Aggregation kinetische Daten verwendet. Diese Software bietet vorläufige kinetische Parameter für eine frühzeitige Bewertung der Ergebnisse und erlaubt dem Benutzer, "große Datenmengen schnell reinigen" ohne seine kinetischen Eigenschaften. Kfits ist in Python implementiert und in open Source bei 45erhältlich.

Eine der schwierigen Fragen im Bereich bezieht sich auf mapping Interaktion stellen zwischen Betreuer und ihre Client-Proteine und das Verständnis, wie Chaperone eine Vielzahl von fehlgefaltete Substraten erkennen. Diese Frage ist komplizierter, wenn Studium hochdynamische Proteinkomplexe, die per se beinhalten Chaperone und Aggregation neigende Substrate ungeordnet. Glücklicherweise, strukturelle Massenspektrometrie hat in den letzten zehn Jahren drastisch fortgeschritten und hat erfolgreich hilfreiche Ansätze und Instrumente zur Analyse der strukturelle Plastizität und Karte Rückstände an Protein Anerkennung46, 47 , 48 , 49. hier präsentieren wir eine solche Technik-Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie (HDX-MS)-die erlaubt die Zuordnung der Rückstandsgehalt Änderungen in eine strukturelle Anpassung auf Protein-Modifikation oder Protein/Ligand verbindlichen35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS nutzt den kontinuierlichen Austausch von Rückgrat Wasserstoffatome durch Deuterium, die Rate von denen ist von der chemischen Umgebung, Erreichbarkeit, betroffen, und kovalente und nicht-kovalente Bindungen56. HDX-MS verfolgt diese Austauschprozesse mit einem deuterierte Lösungsmittel, häufig Schweres Wasser (D2O) und ermöglicht die Messung basiert auf der Veränderung der Molekulargewicht der Wasserstoff zu Deuterium Austausch nach. Langsamere Rate der Wasserstoff-Deuterium Austausch führt aus Wasserstoffatome an Wasserstoffbindungen teilnehmen oder einfach aus sterische Behinderung, die lokale Veränderungen in Struktur57angibt. Änderungen auf ein Ligand-Bindung oder Post-translationalen Modifikationen führen auch zu Unterschieden in der Wasserstoff-Umgebung mit einer Bindung, die resultierenden Unterschiede in der Wasserstoff-Deuterium Austausch (HDX) Preise46,53.

(1) Karte Hsp33 Regionen, die rasch entfalten auf Oxidation, führt zur Aktivierung des Hsp33, und (2) definieren die mögliche verbindliche Schnittstelle des Hsp33 mit seinem Full-Length fehlgefaltete Substrat, Citrat-Synthase (CS)38haben wir diese Technologie angewendet.

In diesem Manuskript beschriebenen Methoden können angewendet werden, um Redox-abhängige Funktionen der Proteine in Vitro, Definition Anti-Aggregation-Aktivität und die Rolle der strukturellen Veränderungen (falls vorhanden) in Proteinfunktion zu studieren. Diese Methoden können leicht verschiedene biologische Systeme angepasst und angewendet im Labor.

Protokoll

1. Vorbereitung von vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteinen

  1. Vorbereitung eines vollständig reduzierte Proteins
    Hinweis: Hier beschreiben wir die Reduzierung eines Zink-haltige Protein und eine ZnCl2 Lösung um den Zn eingearbeitet, reduzierte Protein Zustand wiederherzustellen. Die ZnCl-2 -Lösung kann ersetzt oder verworfen werden. Beachten Sie, dass die Zeit und Temperatur des Reduktionsprozesses hängt die proteinstabilität und Funktion und ist somit spezifisch pro Protein.
    1. Die Protein-Probe auf dem Eis Auftauen und bis zu entfernen Aggregate zu spinnen. Inkubation die Probe mindestens 1,5 h bei 37 ° C mit 5 mM DTT und 20 µM ZnCl2 (bis zu 70 % der Proteinkonzentration).
      Hinweis: Die Temperatur in diesem Schritt ist Protein-abhängig und sollte die proteinstabilität angepasst werden.
    2. DVB-t mit Entsalzung Spalten zu entfernen.
      Hinweis: Es gibt verschiedene Entsalzung Spalten zur Verfügung. Das Protokoll unten beschreibt das Verfahren anhand bestimmte Entsalzung Spalten (siehe Tabelle der Materialien). Bevor Sie anderen Entsalzung Spalten verwenden, empfiehlt es sich, ihre Effizienz der DVB-t-Entfernung und Protein Erholung, zu prüfen, da einige Entsalzung Spalten das Protein des Interesses teilweise absorbieren können.
      1. Equilibrate der Spalte mit einem Kalium-Phosphat (KPi)-Puffer (40 mM, pH 7,5) durch die Spalte mit dem Puffer vollständig füllen und lassen den Puffer heraus tropft. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 X.
      2. Entfernen Sie die weißen Scheibenfilter in der Spalte, indem vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken und herausnehmen; Es ist am einfachsten zu entfernen, während die Spalte mit dem KPi-Puffer gefüllt wird. Füllen Sie die Spalte mit KPi-Puffer und 1.000 x g für 3 min zentrifugieren.
      3. Übertragen Sie die Spalte in ein sauberes Röhrchen, fügen Sie die Protein-Muster langsam bis zur Mitte der Spalte hinzu und bei 1.000 x g für 2 min zentrifugieren. Das DVB-t-freie Protein ist jetzt in der durchströmten.
    3. Überprüfen Sie ihre Konzentrationen (z.B., verwenden Sie ein UV/Vis-Spektrometer) und Messen Sie die Absorption bei 280 nm. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins mit Hilfe des Beerschen Gesetz.
    4. Verteilen Sie die Hälfte der Proteinproben in Aliquote. 20 min für eine vollständige Entfernung von Sauerstoff inkubieren Sie die Aliquote unter anaeroben Bedingungen (z. B.mit einer anaeroben Kammer). Versiegeln Sie die Rohre mit Kunststoff-Folie und speichern Sie die Proben bei-20 ° C oder-80 ° C, abhängig von dem Protein.
      Hinweis: Anstelle der anaeroben Kammer können die Rohre auch mit Argon-Gas, Sauerstoff zu entfernen geflasht werden.
  2. Vorbereitung eines vollständig oxidierten Proteins
    Hinweis: Es wird empfohlen, oxidierte Proteinproben aus vollständig reduzierte Proteinen (wie zuvor beschrieben) vorzubereiten. Dadurch verringert sich die Heterogenität in Oxidationsstufen von Cysteine. Es ist möglich, verschiedene oxidierende Reagenzien zu verwenden; Hier konzentrieren wir uns auf Wasserstoffperoxid (H2O2).
    Achtung: Nicht über-Oxidations, da es gegen unerwünschte Intramolekulare Disulfid-Bindungen und irreversible Oxidation verschiedener Aminosäuren, Cystein, Methionin, Tyrosin und andere einschließlich führen kann.
    1. Die restlichen Protein-Probe 5 mM H2O2 (frisch verdünnt) hinzugeben und unter Schütteln 3 h bei 40 ° C inkubieren.
      Hinweis: Die Temperatur in diesem Schritt ist Protein-abhängig und sollte die proteinstabilität angepasst werden.
    2. Equilibrate der Spalte mit KPi-Puffer (40 mM, pH 7,5) durch die Spalte mit dem Puffer vollständig füllen und lassen den Puffer heraus tropft. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 X.
    3. Entfernen Sie die weißen Scheibenfilter in der Spalte, indem vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken und herausnehmen; Es ist am einfachsten zu entfernen, während die Spalte mit dem KPi-Puffer gefüllt wird.
    4. Füllen Sie die Spalte mit KPi-Puffer und 1.000 x g für 3 min zentrifugieren.
    5. Übertragen Sie die Spalte in ein sauberes Röhrchen, fügen Sie die oxidierte Protein-Muster langsam bis zur Mitte der Spalte hinzu und bei 1.000 x g für 2 min zentrifugieren; Das oxidierte Protein ist jetzt in der durchströmten.
    6. Überprüfen Sie proteinkonzentrationen wie in Schritt 1.2.5, teilen die oxidierte Proteine in Aliquote und bei-20 ° C oder-80 ° C, Protein-abhängige lagern.

2. die Lichtstreuung Aggregation Assay

Hinweis: Alle Konzentrationen in diesem Test sind Chaperon und Substrat-spezifisch, und sollte kalibriert werden. Alle Puffer sollte 0,22 µm gefiltert, da es extrem wichtig ist, dass die Puffer sind frei von jeder Partikel oder Luftblasen und die Küvetten sauber und staubfrei sind. Es ist sehr wichtig, ein Rührer platziert in die Küvette Quarz zu verwenden. Prüfen Sie verschiedene Rührer Größen und Formen gewährleisten eine effiziente Durchmischung der gesamten Lösung ohne unerwünschte Luftblasen zu produzieren. Darüber hinaus gibt es verschiedene Flouorospectrometers in Laboratorien und Anlagen. Hier eine spezielle Fluorospectrometer (siehe Tabelle der Materialien) diente. Verschiedene Instrumente haben eine unterschiedliche Empfindlichkeit, Messgeschwindigkeit und Sampler-Parameter. Daher sollte die genaue Messparameter (z.B.Emissions- und Erregung Bandbreite, Empfindlichkeit und andere) mit einem bekannten Aggregation neigende Protein und seine entsprechende Bedingungen optimiert werden. Verwendung von Citrat-Synthase (CS) und/oder Luciferase als erste Substrate in nanomolaren Konzentrationen wird empfohlen.

  1. Chemischen Aggregation assay
    1. Bereiten Sie das denaturierte Substrat durch Inkubation 12 µM CS Übernachtung in 40 mM HEPES (pH 7,5) und 4,5 M GdnCl. Um den pH-Wert zu erhalten, lösen sich die GdnCl in die 40 mM HEPES (pH 7,5).
    2. Öffnen Sie die Fluorospectrometer-Software und gehen Sie auf Kurs Zeitmessung. Legen Sie die Parameter zu: Temperatur: 25 ° C; ΛEm: 360; EM-Bandbreite: 5 nm; Λ-ex: 360; Ex-Bandbreite: 2,5 nm; und Datenintervall: 0,5 s.
    3. Bereiten Sie die Probe durch Zugabe von 1.600 µL 40 mM HEPES, ein Quarz-Küvetten. Legen Sie die Küvette in den Probenhalter und lassen Sie die Probe, die gewünschte Temperatur zu erreichen.
    4. Das Rühren auf 600 u/min und mit beginnen Sie der Messung, bis eine Baseline hergestellt wird. Halten Sie das Rühren auf für die gesamte Messung.
    5. Zur Messung der CS-Aggregation in Ermangelung von einem Chaperon, bei 120 s in der Messung hinzufügen (sanft, aber schnell) 10 µL denaturierten CS (Endkonzentration von 75 nM). Fortsetzen die Messung für 1200 s.
    6. Zur Messung der CS-Aggregation in Anwesenheit von Hsp33, bei 60 s in der Messung hinzufügen Hsp33 (Endkonzentration von 300 nM). Nach einer weiteren 60 s, fügen Sie 10 µL denaturierten CS (Endkonzentration von 75 nM). Fortsetzen die Messung für 1200 s.
      Hinweis: Wenn das Substrat oder Chaperon, hinzufügen um Einfügung von Luftblasen zu vermeiden, verwenden einer 10 µL Pipette.
  2. Thermische Aggregation assay
    Hinweis: Die Temperatur für die thermische Aggregation Assay hängt die proteinstabilität und sollte für jedes Protein unabhängig voneinander eingestellt werden.
    1. Öffnen Sie die Fluorospectrometer-Software und gehen Sie auf Kurs Zeitmessung. Legen Sie die Parameter wie folgt: Temperatur: 43 ° C; ΛEm: 360; Emission-Bandbreite: 5 nm; Λ-ex: 360; Erregung Bandbreite: 2,5 nm; und Datenintervall: 0,5 s.
    2. Bereiten Sie die Probe durch Zugabe von 1.600 µL vorgewärmten 40 mM HEPES, ein Quarz-Küvetten. Legen Sie die Küvette in den Probenhalter und lassen Sie die Probe 43 ° c erreichen.
    3. Das Rühren auf 600 u/min und mit beginnen Sie der Messung, bis eine Baseline hergestellt wird. Halten Sie das Rühren auf für die gesamte Messung.
    4. Zur Messung der CS-Aggregation in Ermangelung von einem Chaperon, bei 120 s in der Messung hinzufügen sanft CS (Endkonzentration von 125 nM) und weiter Messen für 1.200 s.
    5. Zur Messung der CS-Aggregation in Anwesenheit von Hsp33, bei 60 s in der Messung hinzufügen Hsp33 (Endkonzentration von 600 nM). Nach einer weiteren 60 s, CS hinzufügen (Endkonzentration von 125 nM). Fortsetzen die Messung für 1200 s.
      Hinweis: Wenn das Substrat oder Chaperon hinzufügen, vermeiden Sie das Einfügen von Luftblasen.
  3. Analyse und Lärm Datenentfernung von Kfits
    Hinweis: Kfits finden Sie unter Verwendung von Kfits wurde zuvor bei Rimon Et Al. beschrieben 45
    1. Hochladen Sie die Datendatei.
      Hinweis: Die Eingabe ist die rohe Ergebnisse aus Messungen der Lichtstreuung in ein Textformat kommagetrennten oder Tabulatorzeichen.
    2. Um keinen Lärm zu entfernen, wählen Sie Analyseparameter. Markieren Sie Use- Automatische beste Modell (empfohlen), das Geräusch ist immer über Signal Flag.
    3. Manuell entfernen Sie offensichtliche Ausreißer mit den grünen und roten einstellbare Linien; Dieser Schritt wird den Lärm oberhalb der grünen Linie und unterhalb der roten Linie filtern.
    4. Legen Sie die Grundlinie und die Fit-Kurve. Nach dem Auftragen der Rauschschwelle, herunterladen Sie die verarbeiteten Daten.

(3) Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

  1. Vorbereitung der Puffer und Proteinproben (Hsp33 und Hsp33-CS-Komplex)
    1. Verdünnen Sie die Proteinproben auf eine Endkonzentration von 1 mg/mL in 25 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 und übertragen Sie sie auf 1,5 mL Fläschchen.
    2. Bereiten Sie Protein-Substrat komplexe Proben von Hsp33 mit CS in einem Verhältnis von 1: 1,5 bei 43 ° c Bebrüten vor
      1. Fügen Sie CS in gewissem Sinne schrittweise zu vermeiden schnelle Aggregation und eine fruchtbare Bindung zwischen der Hsp33 und der thermisch entfaltet CS zu gewährleisten.
      2. Verwenden Sie mindestens vier Schritte (d. h., jedes Mal, wenn eine Viertel der letzte Band hinzufügen) und inkubieren Sie die Proben 15 min nach jeder Zugabe um CS Schutz durch Hsp33 zu ermöglichen.
    3. Entfernen Sie alle Aggregate mit einer 30-min Zentrifugation bei 16.000 x g bei 4 ° c
      Hinweis: Neue Protein-Substrat-komplexen müssen frisch zubereitet werden. Substrat-Zugabe sollte schrittweise erfolgen; Andernfalls tritt eine Aggregation auf. Temperatur, Substrat und Substrat-Konzentrationen sind Protein-spezifisch.
    4. Bereiten Sie einen Puffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), die als Deuterierung Kontrolle dient, und einen Puffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), die der Deuterierung Puffer ist. Bereiten Sie auch einen frischen abschrecken Puffer (150 mM DÄMMUND, 3 M GdnCl, 0,1 % Ameisensäure).
      Hinweis: Die abschrecken Puffer sollte für das Protein des Interesses optimiert werden, um seine maximale Sequenz Deckung nach der Verdauung Pepsin zu erzielen.
    5. Übertragen Sie alle Puffer und Proben in Fläschchen, und legen Sie sie in die richtigen Fächer. Halten Sie Puffer H und D bei 25 ° C (Tray 25 ° C); auf der anderen Seite halten Sie die Proben und abschrecken Puffer bei 0 - 2 ° C (0 ° C Fach). Legen Sie die Proben in 150 µL Glaseinsätzen (siehe die Tabelle der Materialien), und übertragen sie dann ins Fläschchen.
  2. Vorbereitung des Instruments
    Hinweis: Das Massenspektrometer kommt mit zwei begleitenden Software-Programme: man steuert die Pumpen und die andere das Massenspektrometer (siehe die Tabelle der Materialien). Die nächsten Schritte werden durch diese beiden Softwareprogramme beschrieben werden.
    1. Alle Kühlgeräte manuell aktivieren. Sobald alle Kühlsysteme ihre zieltemperaturen erreichen, manuell die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Beladung Pumpen einschalten.
      Hinweis: In unserem Fall besteht diese aus zwei kühlende Bäder und eine Kühlbox (enthält die Falle und analytische Säulen). Ein Kühlgerät kühlt das Fach bei 0 ° C, während die andere das Tablett bei 25 ° C hält; die die Kühlbox beträgt 1 bis 2 ° C.
    2. Öffnen Sie die Software, die sowohl Pumpen steuert sowie die Software, die das Massenspektrometer steuert; Stellen Sie sicher, dass MS auf Standbyist.
    3. Die MS-Quelle der HPLC-Auslassventil trennen und waschen das System zunächst mit einem "dreifachen Reiniger" Lösung (1 % Ameisensäure, 33 % Acetonitril, 33 % Isopropanol, 33 % Methanol), dann mit Puffer B (80 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) und schließlich mit Puffer (0,1 % Ameisensäure, pH 2,25), und fügen Sie dann die Pepsin Spalte in das System. Wenn Puffer ändern, stellen Sie sicher, beide Pumpen, bevor Sie fortfahren zu bereinigen.
    4. Sicherstellen Sie, dass die Durchflussmenge für beide Pumpen 0,1 mL/min ist und der Druck stabil ist.
    5. Nach dem Waschen des Systems mit einem stetigen Strom und gleichmäßigen Druck, die MS-Quelle die HPLC-Steckdose stecken und die MS schalten.
  3. Massen-Spektrometer-Parameter
    1. Legen Sie die Peptid-Ionisation, Electrospray Ionisierung (ESI) bei 175 ° C, die Scheide Gasstrom mit 17 Jahren die Aux-Gas-Glow 2 und die Spray-Spannung bei 4,5 kV (ergänzende Abbildung1).
    2. Richten Sie die Parameter wie folgt für die nicht deuterierter Proben.
      1. Legen Sie die Parameter: Scan-Bereich m/Z-300-1500; Auflösung auf 70.000; Automatische Gain Kontrolle Ziel (AGC) bis 106; und die maximale Einspritzzeit (IT) bei 100 ms.
        Hinweis: Die 5 intensivsten Ionen mit Ladungszustände + 2 bis + 6 (ihre Intensität höher als 1,3 x 104) und eine dynamische Fenster von 30 in isoliert werden.
      2. Durchführen Sie die Ionen-Fragmentierung durch höhere Energie Elektronenstruktur Dissoziation (HCD) in der Multiple-Kollision-Zelle mit normalisierten Aufprallenergie (NCE) 28 gleich. Erkennen von Fragment-Ionen per Tandem MS bei einer Auflösung von 35.000, AGC-Ziel von 105, maximal auf 60 ms und eine Isolierung Fenster von 2,0 m/Z.
    3. Beschäftigen Sie für die deuterierte Proben MS1 nur mit einer höheren Auflösung von 140.000 und ansonsten ähnlichen Parametern.
  4. Durchführung des Experiments
    1. Legen Sie die Tabletts auf folgende Weise.
      1. Legen Sie Puffer, H und D im Fach 25 ° C, dann legen Sie die Proben und abschrecken Puffer in die 0 ° C Fach.
      2. Statt X leeren Fläschchen, in beiden Fächern ausgerichtet, wobei X = Anzahl der Proben x die Anzahl der Zeitpunkte.
        Hinweis: In der Schublade 25 ° C die leeren Fläschchen als Reaktionsgefäße dienen, und in das Fach 0 ° C, sie dienen als Fläschchen abschrecken.
      3. Jeder der die leeren Fläschchen enthält eine leere Glaseinsatz; verwerfen und sagte einfügen zwischen Experimente ersetzen.
        Hinweis: Um die HDX-Experiment auf die effizienteste und wenigsten zeitraubende Weise, eine Software laufen die Proben gleichzeitig ausgeführt werden können diente (ergänzende Abbildung2). Die nächsten Schritte werden mit dieser Software beschrieben.
    2. Öffnen Sie die Software. Richten Sie die Programmparameter Folgendes ausführen.
      1. Jede Probe (5 µL) mit 45 µL Puffer D inkubieren Sie für mehrere Minuten, je nach den ausgewählten Zeitpunkten (z.B.1, 3, 18, 40 und 100 min) bei 25 ° C. Stattdessen inkubieren Sie die nicht deuterierter Probe mit 45 µL Puffer H.
      2. Unmittelbar nach der Inkubation 50 µL eiskalt abschrecken Puffer untermischen Sie 50 µL deuterierte Eiweiß und injizieren sie in eine Spalte immobilisierten Pepsin (20 mm in der Länge, 2,0 mm im Durchmesser).
      3. Eluieren Peptide aus der Spalte "Pepsin" in der Pre-Spalte durch Waschen mit Puffer A 6 min mit einer Rate von 50 µL/min halten Puffer A in die Kühlbox bei 0 ° C.
      4. Die Peptide aus der Pre-Spalte in der Trennsäule C18 eluieren (C18 Säule, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, bei 0 ° C gehalten) und trennen Sie diese durch die Anwendung eines linearen Farbverlaufs von Acetonitril 100 µL/min. laufen mit Acetonitril 100 % als Puffer B Acetonitril-Gradient : 7 min. bei 2 %, 7 min bei 10-30 %, 2,5 min bei 30-90 %, 1,5 min bei 90 %, rasante Steigung für 1 min bei 90-8 %, und schließlich equilibrate die Spalte 4 Minuten bei 2 %.
    3. Eine laufende Sequenz zu bauen (siehe ergänzende Abbildung 2): Geben Sie alle Zeitpunkte, Beispielnamen, und Standorten in die Fächer sowie die Puffer-Namen und Standorten.
      Hinweis: Die Software ermöglicht die Ausrichtung der verschiedenen Laufzeiten in ein Programm, die mehrere Proben gleichzeitig, effizient verringern Laufzeiten ausgeführt wird.
  5. Datenanalyse
    Hinweis: Wir arbeiten mit mehreren Software-Programme in den Prozess der Datenanalyse, einschließlich Proteome Entdecker und MaxQuant (freie Software) für die Peptid-Identifikation und Analyse der Sequenz Abdeckung sowie HDX Werkbank, eine Kostenlose Software, der die Analyse der Deuterium-Einbau in Proteine und ein Vergleich der HDX-Raten zwischen verschiedenen Experimente ermöglicht. Die nächsten Schritte werden durch diese Software-Programme beschrieben werden.
    1. Analysieren Sie die Peptid-Abdeckung der Probe durch die Ausführung nicht deuterierter Kontrollproben durch die Software (ergänzende Abbildung 3). Die Software mit den folgenden Parametern einstellen.
      1. Die Sequest HT-Methode mit einem No-Enzym (unspezifischen) Spalten. Suche nach Peptide 4-144 Aminosäuren mit einer Masse Toleranz von 7 ppm und 0,5 Da für die Vorläufer Ionen und Fragment. Ermöglichen Sie eine dynamische Methionin-Oxidation.
      2. Erstellen Sie eine Datenbank für das Protein, durch das die Software die Peptid-Berichterstattung bestimmen kann. Exportieren Sie die identifizierten Peptide im Textformat.
    2. Analysieren Sie die deuterierte Ergebnisse mit Hilfe der HDX Werkbank freie Software58.
      1. Die Protein-Editor öffnen und das Protein durch Einfügen der Protein-Sequenz und Peptid-Abdeckung-Datei definieren.
      2. Als nächstes öffnen Sie den Setup Assistenten experimentieren Editor und geben Sie alle Eingaben, die angefordert.
        Hinweis: Das Programm muss die Anzahl der Samples, die Anzahl der Zeitpunkte, die Anzahl der Wiederholungen, der pH-Wert der Puffer und der Temperatur.
      3. Zu guter Letzt die Eingabeparameter betreffend das Massenspektrometer verwendet, nach denen das Programm eine Liste der gefundenen Peptide erzeugt.
        Hinweis: Die Software erkennt die "HDX" Peptide, Isotop Cluster inspiziert und zeigt eine klare Visualisierung der Deuterierung in den Proben.
  6. Darstellung der Daten
    1. Beschriften Sie die Regionen mit einer respektvollen Deuterierung Akzeptanz auf des Schachts PyMol -Software oder andere Visualisierungs-Software.
    2. Die Deuterium Aufnahme Ebenen anstelle der B-Faktor Werte einzuführen.
      Hinweis: Ein grundlegendes Tutorial finden Sie auf https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Ergebnisse

Die zwei vorgestellten Methoden ermöglichen es, die kinetische Aktivität und Dynamik von Protein-Interaktionen zwischen einem Chaperon und seinem Substrat zu folgen. Darüber hinaus ermöglicht die Reduzierung-Oxidation-Protokoll die Zubereitung vollständig reduziert und vollständig oxidierten Chaperon, geben ein vertieftes Verständnis des Aktivierungsmechanismus der ungeordneten Chaperone Redox-abhängige.

Erstens haben wi...

Diskussion

In diesem Papier stellten wir Protokolle für die Analyse der Redox-abhängige Chaperone Aktivität und die Charakterisierung von strukturellen Veränderungen auf die Bindung eines Client-Proteins. Dies sind komplementäre Methoden, um potenzielle Chaperon-Substrat-komplexen zu definieren und analysieren mögliche Standorte werden Interaktion.

Hier haben wir diese Protokolle für die Charakterisierung eines Komplexes zwischen der Redox-regulierten Chaperon Hsp33 mit einem gut untersuchte Chape...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar, dass Meytal Radzinski für ihre hilfreichen Diskussionen und kritische Lektüre des Artikels, und Patrick Griffin und seine Labor-Mitgliedern für ihre uneingeschränkte Unterstützung beim Aufbau der HDX-Analyse-Plattform. Die Autoren sind dankbar, dass der Deutsch-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), der binationale Science Foundation (2015056), Marie-Curie-Integration Grant (618806), der Israel Science Foundation (1765/13 und 2629/16), und das Human Frontier Science Programm (CDA00064/2014) für ihre finanzielle Unterstützung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5Lsolvent
Formic acid Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC gradeFisher ChemicalsP750717solvent
MethanolFisher ChemicalsA456-212solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich252859buffer
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich76-05-1solvent
Water for HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Msolvent
ZnCl2, Zinc ChlorideMerckB0755416 308reagent
DTTgoldbio27565-41-9reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcareGE healthcare29-9180-07desalting column
Potassium PhosphateUnited states Biochemical Corporation20274buffer
Hydrogen peroxide 30%MerckK46809910526oxidizing agent
citrate synthasesigma aldrichC3260substrate
HEPES acid freesigma aldrich7365-45-9buffer
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdenaturant
Deuterium Chloride Solutionsigma aldrich543047-10Gbuffer
Deuterium Oxide 99%sigma aldrich151882-100Gsolvent
TCEPbioworld42000058-2reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvetteHellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 FluorospectrometerJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifugeThermo Scientific
pH meter , PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm)Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock doorCOY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometerThermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samplesPAL systemhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pumpThermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pumpThermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Datahttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench softwarehttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

Referenzen

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. . Free radicals in biology and medicine. , (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiochemieAusgabe 136ChaperoneRedox regulierten ChaperonHsp33ATP unabh ngige ChaperonProteinaggregationWasserstoff Deuterium AustauschHDX MSProtein Aggregation Kinetik und AnalyseProtein Oxidation und Reduktion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten