Quantifizierung der Pflanze lösliche Protein und verdauliche Kohlenhydrate Inhalt, Verwendung von Mais (Zea Mays) als ein Exemplar

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Protokolle liefern eine klare und ansprechbar Methodik zur Messung der lösliche Protein und verdaulich (nicht tragende) Kohlenhydratgehalt in Pflanzengeweben. Die Fähigkeit, diese zwei Pflanze Makronährstoffe quantifizieren hat erhebliche Auswirkungen für die Förderung der Felder der Pflanzenphysiologie, ernährungsphysiologischen Ökologie, Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen und Nahrungsnetz Ökologie.

Zusammenfassung

Elementare Daten werden häufig verwendet, Qualität der Pflanze als eine Ressource für Pflanzenfresser abzuleiten. Die Allgegenwart des Kohlenstoffs in Biomolekülen, die Anwesenheit von Stickstoff-haltigen defensive Pflanzenstoffe und Variation in artspezifische Korrelationen zwischen Stickstoff und pflanzlichen Eiweißgehalt alle schränken jedoch die Genauigkeit der diese Rückschlüsse. Darüber hinaus Forschung konzentriert sich auf Anlage und/oder Pflanzenfresser Physiologie erfordern ein Maß an Genauigkeit, die nicht erreicht wird mit Korrelationen verallgemeinert. Die hier vorgestellten Methoden bieten Forscher eine klare und schnelle Protokoll für lösliche Pflanzenproteine und verdauliche Kohlenhydrate, die zwei Pflanze Makronährstoffe meist eng mit physiologischen Tierleistung direkt zu messen. Die Protokolle kombinieren gut charakterisierten farbmetrischen Assays mit optimierten anlagenspezifischen Verdauung Schritten präzise und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Unsere Analysen der verschiedenen Zuckermais Gewebe zeigen, dass diese Tests die Sensibilität haben zu erkennen Variation in Pflanzen lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten in mehreren räumlichen Skalen. Diese Unterschiede zwischen Pflanze über wachsende Regionen und Pflanzenarten oder Sorten gehören, ebenso wie in-Pflanze in Gewebetyp und sogar positionellen Unterschiede innerhalb der gleichen Gewebe. Kombination von löslichen Proteinen und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten mit elementaren Daten hat auch das Potenzial, neue Möglichkeiten in Pflanzenbiologie, mineralischen Pflanzenernährung mit physiologischen Anlagenprozesse zu verbinden. Diese Analysen helfen auch generieren die lösliche Protein und verdaulichen Kohlenhydraten Daten musste studieren ernährungsphysiologischen Ökologie, Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen und Nahrungsnetz Dynamik, die wiederum Physiologie und ökologische Forschung gestärkt werden.

Einleitung

Pflanzlicher Biomasse bildet die Grundlage für praktisch alle terrestrischen Nahrungsketten. Pflanzen Nährstoffe aus dem Boden über ihre Wurzeln zu erwerben und nutzen Sonnenlicht in ihrem Blatt-Gewebe Biomoleküle zu synthetisieren. Vor allem Kohlenstoff und Stickstoff werden verwendet, um Kohlenhydrate, Proteine (bestehend aus Aminosäuren) zu erstellen, und Lipide, die erforderlich sind, bauen pflanzlicher Biomasse (es sei darauf hingewiesen, dass in Pflanzen Physiologie bezieht sich der Begriff "Makronährstoffs" oft auf Boden-Elemente, z. B. N, P, K und S, jedoch verweisen in diesem Artikel der Begriff Biomoleküle wie Proteine, Kohlenhydrate und Lipide auf). Als Pflanzenfresser Pflanzenmaterial verbrauchen, sind die Makronährstoffe in Pflanzengewebe enthalten in ihre Bestandteile zerlegt und dann verwendet, um die physiologischen Prozesse des Verbrauchers zu fahren. Auf diese Weise haben Pflanze Makronährstoffe einen starken Einfluss auf Verbraucher Physiologie sowie wichtige Implikationen für höhere Ordnung ökologische Wechselwirkungen und Nahrungsnetz Dynamik.

Über das Tierreich sind lösliche Protein und verdauliche Kohlenhydrate die Makronährstoffe, die am ehesten zu überleben, Fortpflanzung und Leistung¹gebunden. Darüber hinaus Regeln die Mehrzahl der Tiere aktiv ihre Einnahme von diesen beiden Makronährstoffe kennenlernen ihrer physiologischen Anforderungen^1,2. Dies gilt insbesondere für Insekten Pflanzenfresser, die erkennen, die Konzentration von Zucker und Aminosäuren in Pflanzengeweben, die wiederum Fressverhalten leitet. Infolgedessen Pflanze lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten hat eine starke Rolle in der Evolution von Pflanzen-Insekten-Interaktionen.

Während Daten zur Anlage lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten relativ selten sind (aber siehe^{6,7,8,9,10,11}), gibt es ein Übergewicht von Daten zur Anlage elementare Inhalte (Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor). Vor allem deshalb, weil Elemente eine wichtige Rolle im Werk Mineralnährstoffe^{3,4,5 spielen}. Wo Elemente gemessen werden, Zusammenhänge wurden verwendet, um die Menge an löslichen Protein und verdauliche Kohlenhydrate zu extrapolieren, aber genaue Berechnungen sind oft schwer zu bekommen. Beispielsweise ist es unmöglich, Kohlenstoff als Indikator Pflanze verdauliche Kohlenhydrate Inhalte zu verwenden, da Kohlenstoff in alle organischen Verbindungen ubiquitär vorhanden ist. Eine stärkere Beziehung besteht zwischen elementaren Stickstoff und Pflanze lösliche Protein-Inhalt, und generalisierte Stickstoff-Protein Umrechnungsfaktoren werden häufig genutzt. Allerdings gibt es starke Hinweise, dass Stickstoff-Protein Konvertierungen höchst artspezifische^{12,13,14,15 sind}, Nutzung der generalisierten Umwandlung wahrscheinlich ungenau. Aus diesem Grund ungenau Stickstoff-Protein Umrechnungsfaktoren oft, besonders in dem Maße, die für Ernährungsstudien an Pflanzenfresser erforderlich ist. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von N-haltigen Pflanzen allelochemischer, z. B. Alkaloide und glucosinolate, die oft giftig für Pflanzenfresser, sind diese Konvertierungen verwechseln.

Hier bieten wir zwei chemische Tests zur Messung der Konzentration von löslichen Proteinen und verdauliche Kohlenhydrate in pflanzlichen Geweben. Diese Tests werden separat vorgestellt, aber es wird empfohlen, dass sie gleichzeitig verwendet werden, die gleichen Pflanzenproben zu analysieren um eine umfassendere Analyse der Pflanze Makronährstoffe zu erreichen. Beide beschäftigen ähnliche Methoden, d. h. eine Extraktion, gefolgt von Quantifizierung über Absorption. Pflanze Probe Prep ist auch identisch für beide Protokolle, macht es einfach, beide Analysen parallel laufen. Das Dienstprogramm diese Assays nicht ergeben sich aus ihre Neuheit, da sie sich auf ältere, verlassen (Bradford, Jones, Dubois) etablierte farbmetrischen Assays^16,17,18, aber hier organisierten wir eine klare und leicht verständliche Protokoll, das diese Methoden eher obskuren anlagenspezifischen Extraktion Techniken^17,19 kombiniert, um die Anwendung dieser Assays für diejenigen in Anlage-relevanten Bereichen besser zugänglich zu machen.

Für beide Assays werden Pflanze Makronährstoffe zuerst körperlich durch Einfrieren, Lyophilisation und Schleifen das Pflanzenmaterial extrahiert. Die lösliche Protein Assay weitere chemische Extraktion^17,19 durch mehrere Runden von aufschütteln und Heizung Proben in NaOH Lösung erfolgt. Bekannten Bradford-Test, Verwendung von Coomassie brilliant blue G-250, wird dann verwendet, um lösliche Proteine und Polypeptide zwischen 3.000-5.000 Dalton^16,17zu quantifizieren. Dieser Test hat eine Reichweite zwischen 1-20 µg Gesamt Protein pro Mikrotestplatte gut oder < 25 µg/mL, aber tut nicht Maßnahme Freie Aminosäuren. Extraktionsschritt verdauliche Kohlenhydrate Assay basiert auf die verdünnte Säure Methode von Smith Et al. ²⁰ und die Isolation der lösliche Zucker, Stärke, und Fructosan – aber nicht strukturelle Kohlenhydrate erlaubt. Ein Phenol-schweflige Säure Quantifizierungsmethode stammt von Dubois Et al. ¹⁸ und misst alle Mono-, Oligo-Polysaccharide (sowie und Methyl-Derivate). Dieser Test ist in der Lage, bestimmte Zucker zu quantifizieren, aber hier benutzen wir es als Indikator für den Gehalt an Gesamt verdaulichen Kohlenhydraten (siehe Smith Et Al. ²⁰ für eine detailliertere Analyse). Diese Tests messen zusammen, die beiden Makronährstoffe, die stark gebunden sind, um Öko-Physiologie Pflanzenfresser, Leistungsfähigkeit sowie die Bereitstellung von wichtiger Daten auf Ressource Qualität an der Basis der terrestrischen Nahrungsketten zu Pflanzen. Präsentiert diese Protokolle fördert die Generation der Pflanze Makronährstoff-Datasets, um eine tiefer gehende Verständnis der Pflanzenphysiologie, Herbivore Ernährung Ökologie und Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen zu erhalten.

Protokoll

1. Erhebung und Verarbeitung zu Pflanzen

1. Erfassung und Verarbeitung von Pflanzenproben
   1. Nach dem Sammeln Pflanzenproben, Schockfrosten Sie Proben durch Eintauchen Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff mit Zange und Store bei-80 ° C. Wenn die Pflanzenproben gesammelt sind zu groß zum Schockfrosten, schnell kühlen die Proben mit Trockeneis und Transfer zu einem-80 ° C Gefrierschrank so bald wie möglich. Der Makronährstoff-Inhalt von Pflanzenmaterial kann ändern, nachdem Gewebe von der Pflanze getrennt sind, deshalb es wichtig ist, Pflanzenproben so bald wie möglich nach der Entnahme einzufrieren.
      Vorsicht: Flüssiger Stickstoff kann zu schweren Erfrierungen bei Berührung mit der Haut führen. Bitte stellen Sie sicher zum transport von flüssigen Stickstoffs in zugelassenen Behältern und ordnungsgemäße PSA während der Handhabung, einschließlich Kryo-Handschuhe, Auge Googles, Gesichtsschutz, Schürze und einen Laborkittel zu tragen.
   2. Lyophilize Pflanzenmaterial mit einem Einfrieren-Trockner um sicherzustellen, dass das Gewebe metabolisch inaktiv sind, während Wasser entfernt wird. Trocken bis die Masse der Probe stabilisiert um sicherzustellen, alle Wasser entfernt wurde.
   3. Einmal Proben trocken sind, zu einem feinen Pulver mit einer Schleifmaschine oder Mühle mahlen. Speichern Sie Proben in einem austrocknende Schrank bis zur Analyse.

(2) lösliche Protein Assay

1. Vorbereitung der Probe
   1. Wiegen Sie replizieren Proben von jedem Gewebe, etwa 20 mg in 1,5 mL Polystyrol Mikrozentrifugenröhrchen und Label-Röhren. Diese Proben werden anschließend als unbekannte Proben bezeichnet werden. Nehmen Sie die genaue Masse von jeder Probe, wie diese Informationen benötigt werden, um die % lösliche Protein in jedem unbekannten Probe zu berechnen. Verwenden Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit Verriegelung Deckel, wie nicht-Verriegelung Deckel während der nachfolgenden Heizung Schritt, was zum Verlust der Beispiellösung öffnen können.
2. Solubilisieren und unbekannten Probe Proteine zu isolieren
   1. Jedes Rohr mit einer Mikro-Pipette, 500 µL 0.1 M NaOH hinzufügen. Deckel verschließen und für 30 Minuten beschallen. Heizen Sie eine heißes Wasser Bad 90 ° C.
      Vorsicht: Natriumhydroxid ist eine starke Basis und Verbrennungen bei Berührung mit der Haut verursachen können. Obwohl die 0,1 M NaOH eine niedrige Konzentration darstellt, Schutzhandschuhe um Hautreizungen zu vermeiden.
   2. Legen Sie Rohre für 15 Minuten in einem Rack in dem heißen Wasserbad.
   3. Zentrifugieren Sie Röhren bei 15.000 x g für 10 Minuten. Pipette die überstehende Flüssigkeit in neue beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen, mit einer neuen PIPETTENSPITZE für jede Probe. Das Rohr mit dem Pellet und Zentrifuge wieder bei 15.000 x g für 10 Minuten fügen Sie 300 µL 0.1 M NaOH hinzu. Wieder, sammeln Sie die überstehende Flüssigkeit und kombinieren Sie es mit der anderen überstehende Flüssigkeit aus der gleichen Probe. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial und Proben können bei 4 ° C über Nacht gelagert werden, wenn nötig.
3. Pflanzliche Proteine ausgefällt
   1. Neutralisieren Sie der pH-Wert der überstehenden Lösung durch Zugabe von 11 µL 5,8 M HCl. bestätigen einen pH-Wert von ~ 7 durch Eintauchen Lackmuspapier in jede Probenlösung.
      Vorsicht: Salzsäure ist eine stark ätzende Säure, die Verbrennungen bei Berührung mit Haut (Haut Anwendung oder Inhalation) verursachen können. Bitte tragen Sie Handschuhe, um zu verhindern, dass die Reizung der Haut beim Umgang mit HCl.
   2. Jedes Rohr 90 µL 100 % Trichloressigsäure Säure (TCA) hinzufügen und 30 Minuten Röhren auf Eis inkubieren. Die Fällung von Proteinen schaltet die Lösung von klar bis opak. Geschieht dies nicht nach 30 Minuten, kühlen Sie die Röhren für 1 Stunde. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial und Proben können bei 4 ° C über Nacht gelagert werden, wenn nötig.
      Vorsicht: Trichloressigsäure Säure ist ätzend. Bitte tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit verhindern den Kontakt mit Haut und Inhalation vermeiden.
   3. Zentrifuge Proben bei 13.000 x g für 10 Minuten bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig die TCA Überstand durch Absaugen es mittels einer Vakuumleitung befestigt, ein feines Glas Mikropipette Tipp (der gleichen Tipp kann über Proben verwendet werden). Nicht stören das Protein Pellet durch Vermeidung von schweren Saug- und halten einen angemessenen Abstand zwischen Pipettenspitze und das Pellet.
   4. Waschen Sie Pellet schnell mit 100 µL-20 ° C Aceton. Dieser Schritt entfernt alle verbleibenden TCA aus Pellets, die mit der nachfolgenden Bradford-Test stören können; Aceton beginnt jedoch die Protein-Pellet auflösen, wenn Links in Kontakt zu lang, so dass Aceton hinzugefügt werden soll, dann schnell extrahiert aus der Pellets innerhalb von 5 Sekunden.
   5. Aceton verdunstet durch die Platzierung der Rohre in einer Dampfhaube oder Kühlschrank zu ermöglichen. Dann Auflösen der Protein-Pellet durch Zugabe von 1 mL 0,1 M NaOH auf jedes Rohr. Vollständig auflösen das Pellet erfordern mehrere Runden der Heizung in heißem Wasser Bad, aufschütteln und beschallen.
      Hinweis: Je länger die Röhren sitzen in der Dunstabzugshaube oder Kühlschrank und je trockener die Pellets erhalten, desto schwieriger werden sie wieder lösen. Es wird empfohlen, die Tablette 30 Minuten trocknen lassen und dann auf das Vorhandensein von Aceton prüfen alle 10-15 Minuten, bis es ist klar, dass das Aceton verdunstet ist (kein Aceton Dämpfe sind nachweisbar).
4. Mischen Sie Standardlösungen zu, verdünnen Sie unbekannte Beispiellösungen und quantifizieren Sie der Gesamtproteingehalt der unbekannten Proben mit der Bradford-Test.
   1. Bereiten Sie bovine Immunglobulin G (IgG)-standard-Lösungen entsprechend den Konzentrationen, die in Tabelle 1 (lyophilisiert oder IgG-Stammlösung mischbar mit entionisiertem Wasser, jede Konzentration zu erreichen) aufgeführt. Normen bei 4 ° c Lagern In einer 96-Well-Platte hinzufügen 160 µL jedes IgG-Standardlösung in dreifacher Ausfertigung beginnend mit der A1-Position von der well-Platte (0 µg/µL in A1, A2, A3 positionieren, 0,0125 µg/µL in B1, B2, B3 Positionen, etc.).
   2. Bereiten Sie eine verdünnte NaOH-Lösung durch Zugabe von 50 µL 0.1 M NaOH auf 950 µL destilliertes Wasser. Als eine leere Negativkontrolle fügen Sie 60 µL dieser Lösung die well-Platte in dreifacher Ausfertigung (G1, G2, G3-Positionen hinzu).
   3. Bereiten Sie Verdünnungen der unbekannten Proben durch Zugabe von 50 µL jeder Probe Lösung um 950 µL destilliertes Wasser in einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch vor. Fügen Sie dann 60 µL jeder verdünnte Probe, die well-Platte in dreifacher Ausfertigung, beginnend bei der H1-Position. Eine 96-Well-Platte sollte für die Analyse von 6 Normen, 1 Blank und 25 unbekannte Proben in dreifacher Ausfertigung beim Lesen ermöglichen. Jedes well-Platte analysiert sollte eine eigene IgG standard und leere enthalten.
   4. Alle leeren und unbekannten Proben Brunnen 100 µL destilliertes Wasser hinzufügen. Jetzt sollte jeder gut enthalten, insgesamt 160 µL. mit einer Multi-Kanal-Pipette (8 Kanäle), fügen Sie 40 µL Coomassie brilliant blau G-250 Protein färben zu jedem gut in der ersten Spalte der well-Platte. Den Farbstoff mit den Proben zu mischen, mehrmals zu stürzen. Wiederholen Sie für alle anderen Spalten, Pipettenspitzen zur Vermeidung von Kontaminationen zu ersetzen.
      Vorsicht: Coomassie brilliant blue G-250 ist ein Reizmittel und Kontakt mit Haut, Augen oder Lungen sollten vermieden werden. Bitte tragen Sie Handschuhe, um Hautkontakt zu vermeiden. Wenn Kontakt mit der Haut auftritt, wird dieses Produkt Beflecken.
   5. Verwenden Sie eine Nadel Pop Bläschen in den Brunnen vorhanden, wie sie mit dem Mikrotestplatte Spektralphotometer lesen beeinträchtigen. Reinigen Sie die Nadel zur Vermeidung von Kontamination zwischen Brunnen. Lassen Sie die Mikrotestplatte für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Mit einer Mikrotestplatte Spektralphotometer, zeichnen Sie die Absorption Werte für jedes gut bei 595 nm.
   7. Zeichnen Sie die durchschnittliche Absorption für die drei leeren Brunnen und subtrahieren Sie diesen Wert aller Standard- und unbekannte Probe Lesungen. Notieren Sie die durchschnittliche Extinktion für jede Standard- und unbekannte Probe.
      Hinweis: Um die Menge an Protein in jedem unbekannten Probe mit der Standardkurve zu berechnen, ist es am einfachsten, die durchschnittliche Extinktion jeder Norm gegen Mikrogramm Protein vorhanden in jedem Standard zurückbilden, aber man kann die Konzentration des Proteins (µ Plotten g/µL) jeder Norm, wenn erwünscht. Die folgenden Berechnungen beziehen sich allerdings auf eine Standardkurve basierend auf Mikrogramm, nicht Konzentrationen (µg/µL).
   8. Zeichnen Sie die durchschnittliche Extinktion jeder Norm gegen die Gesamtmenge an Protein in jedem Standard gut (Tabelle 1) vorhanden. Passt einer linearen Regressionsgeraden auf diese Daten und verwenden Sie die Gleichung zur Berechnung des Proteins (µg) in jedem unbekannten Probe gut anhand der durchschnittlichen Extinktion (Abbildung 1a).
      Hinweis: Der Korrelationskoeffizient (R -Wert) von dieser Linie sollte größer als 0,98 und routinemäßig in der Nähe von 0,99. Die standard Regression wird spezifisch für jede Platte, daher müssen der unbekannten Probe Brunnen in jeder Platte getrennt analysiert werden.
   9. Sobald die durchschnittliche Menge an Protein für jedes unbekannte Probe gut berechnet wird, verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Gesamtmenge an Protein (µg) in jeder ursprünglichen Probe zu berechnen:
      M_p = (((W_p60) X 1000) / 50) * 1000
      M_p = µg Protein in der Originalprobe
      W_p = µg Protein in der unbekannten Probe gut
      1. Verwenden Sie dann die folgende Gleichung den Anteil des Proteins in jeder Probe bestimmen:
         P_p = ((M_p/1000) / m_i) * 100
         P_p = % Protein in Probe
         M_ich = Ausgangsmasse der Probe (mg)
         Hinweis: In einigen Fällen kann die Probe die oberen Extinktion Schwelle übertreffen. Wenn ja, können Beispiellösungen weitere Verdünnung bei Schritt 2.4.3 verlangen.
         Weitere Verdünnungen müssen dann in nachfolgenden Berechnungen berücksichtigt werden. Einige Mikrotestplatte Leser Marken bieten auch Computer-Software, die automatisch die durchschnittliche Proteinkonzentration jeder unbekannte Probe anhand der Standardkurve Daten berechnet.

(3) verdauliche Kohlenhydrate Assay

1. Vorbereitung der Probe
   1. Wiederholte Proben von jedem Gewebe, etwa 20 mg abwiegen, in Glas 15 mL Tuben mit gummierte Schraubverschlüsse (100 mm Länge). Diese Probe wird anschließend als unbekannte Proben bezeichnet werden. Kennzeichnen Sie Rohre mit einem wasserfesten Filzstift oder mit Klebeband auf den Deckeln Kennzeichnung und nehmen Sie die genaue Masse von jeder Probe auf, da diese Information benötigt wird, um die % Kohlenhydrate in jedem unbekannten Probe zu berechnen.
2. Extrahieren Sie verdauliche Kohlenhydrate aus jedem unbekannten Probe.
   1. Fügen Sie 1 mL 0,1 M H₂, damit₄ jede Tube und Schraubverschlüsse auf fest Rohre. Legen Sie in ein kochendes Wasserbad für 1 Stunde.
      Vorsicht: Schwefelsäure ist stark ätzend. Bitte tragen Sie Handschuhe, Googles Auge und eine Schürze beim Umgang mit H₂SO₄ und führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube.
   2. Rohre in ein lauwarmes Wasserbad abkühlen. Gießen Sie Rohr Inhalt in beschrifteten 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (seien Sie nicht beunruhigt, wenn einige materielle Überresten in die Glasröhren Pflanzen).
   3. Zentrifugieren Sie Röhren bei 15.000 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie die überstehende Flüssigkeit mit einem Mikro-Pipette und Ort in neue beschriftete 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Rohre können an dieser Stelle über Nacht gekühlt werden. Wenn mit Assay fort, finden Sie unter Schritt 3.3.2.
3. Mischen Sie Standardlösungen und quantifizieren Sie den gesamten verdaulich Kohlenhydratgehalt unbekannter Proben zu.
   1. Bereiten Sie D(+) Glukose Standardlösungen mit den Konzentrationen in Tabelle 2aufgelistet. Bereiten Sie sechs Glas-Reagenzgläser mit 400 µL jeder standard-Lösung.
   2. Pipette 15 µL jeder unbekannte Probe in eine eigene Reagenzglas und jeweils für ein Gesamtvolumen von 400 µL in jedes Reagenzglas 385 µL destilliertes Wasser hinzufügen. In einer Dampfhaube jedes Reagenzglas standard und unbekannte Probe 400 µL 5 % Phenol hinzu, und dann schnell pipette 2 mL konzentrierter H₂SO₄ in jedem Rohr. Berühren Sie das Reagenzglas Inhalt mit der Pipettenspitze nicht, fügen Sie einfach auf die Lösung-Oberfläche (eine Repeater-Pipette eignet sich am besten für diese).
   3. Rohre für 10 Minuten inkubieren lassen und dann sorgfältig Wirbel der Rohre, Inhalt zu mischen. Inkubieren Sie für weitere 30 Minuten.
      Vorsicht: Phenol und Schwefelsäure sind ätzende Reizstoffe. Zum Schutz vor Kontakt mit Haut, Augen und Inhalation dieser Schritt durchgeführt werden, in einem chemischen Abzug mit der richtigen PSA, umfasst: Gesicht Schild oder Auge Schutzbrille, Gummihandschuhe, Laborkittel und Stiefel. Mischergebnisse Phenol mit Schwefelsäure auch in einer exothermen Reaktion, führt die in den Rohren wird heiß.
   4. Pipette 800 µL Probe aus jeder Tube in jeder der 3 Polystyrol 1,5 mL Halbmikrowaagen Küvetten (3 Technische Wiederholungen pro Probe). Setzen das Spektrophotometer auf 490 lesen nm. Um eine leere Küvette mit destilliertem Wasser vor Normen oder unbekannte Proben zu lesen, und zeitweise in der gesamten Stichprobe Lesungen zu kalibrieren. Ein Spektralfotometer jedes Küvette durchziehen und aufnehmen der Extinktion. Durchschnitt über technische wird für jede unbekannte Probe repliziert.
      Hinweis: In einigen Fällen können Proben die oberen Extinktion Schwelle übertreffen. Wenn ja, sollten die Proben bei Schritt 3.2.3 verdünnt werden. Verdünnungen müssen auch in nachfolgenden Berechnungen berücksichtigt werden.
   5. Berechnen Sie die durchschnittliche Extinktion für jeden Standard.
      Hinweis: Zur Berechnung des gesamten verdauliche Kohlenhydrate, die in jedem unbekannten Probe mit der Standardkurve, am einfachsten ist es, die durchschnittliche Extinktion jeder Norm gegen Mikrogramm D (+) Glucose vorhanden in jedem Standard zurückbilden, aber man kann auch Plotten Sie D (+)-Glukosekonzentration (µg/µL) jeder Norm, wenn erwünscht. Die folgenden Berechnungen beziehen sich allerdings auf eine Standardkurve basierend auf Mikrogramm, nicht Konzentrationen (µg/µL).
   6. Berechnen Sie die Standardkurve durch Plotten die durchschnittliche Extinktion gegen die Gesamtmenge D (+) Glucose (µg) in jede standard-Lösung. Passen Sie einer linearen Regressionsgeraden auf diese Daten zu, und verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Gesamtmenge der Kohlenhydrate (µg) in jedem unbekannten Probe zu berechnen:
      M_c = (((A_X -b)/m)/(15)) * 1000
      M_c = µg von Kohlenhydraten in Probe
      Ein_X = durchschnittliche Absorption der unbekannten Probe
      b = y-Achsenabschnitt (standard Regressionsgerade)
      m = Steigung (standard Regressionsgerade)
      Der Korrelationskoeffizient dieser Linie sollte größer als 0,98 und routinemäßig in der Nähe von 0,99. Verwenden Sie dann die folgende Gleichung, den Anteil der Kohlenhydrate in jeder Probe bestimmen:
      P_c = ((M_c/1000) / (M_i)) * 100
      P_c = % Kohlenhydrate
      M_ich = Ausgangsmasse der Probe (mg)

Ergebnisse

Um den Nutzen dieser Methoden zeigen, analysierten wir die lösliche Protein und verdaulich Kohlenhydratgehalt von vier verschiedenen Feld und Zuckermais Gewebe, die als unterschiedliche mögliche ernährungsphysiologischen Ressourcen für Insekten Pflanzenfresser dienen. Wir von drei landwirtschaftlichen Gebieten in den USA (Minnesota, North Carolina und Texas), Ähren gesammelt umfasst fünf verschiedene Sorten von Mais (d. h. Genotypen) und eine Vielzahl von Feld Mais als ein ...

Diskussion

Durch die Kombination von etablierten farbmetrischen Assays mit effektive Absaugung der anlagenspezifischen Protokolle, bieten die Assays zeigte hier eine vernünftigste und präzise Methode zur Messung der Pflanze lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten. Unsere Ergebnisse mit Mais als ein Musterbeispiel wie diese Protokolle verwendet werden können veranschaulicht, um präzise Messungen in verschiedenen biologisch relevanten räumlichen Skalen zu erhalten. Zum Beispiel konnten wir Unterschiede in lö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
microplate reader (spectrophotometer)	Bio-Rad	Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate	Bio-Rad	#5000006	450mL