酿酒酵母间歇培养中的指数生长动力学分析呼吸和发酵代谢

在这里, 我们提出了一个协议, 以估计的呼吸和发酵代谢通过适当的指数增长的酿酒酵母的指数增长方程。动力学参数的计算允许筛选物质/化合物对发酵或线粒体呼吸的影响。

酵母细胞在指数阶段通过发酵和/或线粒体呼吸产生 ATP 来维持其生长。发酵碳浓度主要控制酵母细胞如何产生 ATP;因此, 发酵碳水化合物水平的变化推动了酵母的能量代谢。本文介绍了一种基于指数酵母生长的高通量方法, 以估计浓度变化和碳源性质对呼吸和发酵代谢的影响。通过测定 600 nm 的光密度 (OD), 在微板块或摇动的锥形烧瓶中测定酵母的生长。然后用绘制 OD 与时间的方法建立生长曲线, 允许指数相的识别和选择, 并配以指数增长方程获得动力学参数。低特异增长率以加倍倍的速度通常代表呼吸增长。反之, 更高的特定增长率以低倍倍的速度表明发酵生长。利用已知的呼吸或发酵条件, 如非发酵碳源或较高浓度的发酵糖, 估计加倍时间和特定生长速率的阈值。这是为每个特定的应变得到。最后, 将所计算的动力学参数与阈值进行比较, 确定酵母是否显示发酵和/或呼吸生长。这种方法的优点是它相对简单, 了解物质/化合物对发酵或呼吸代谢的影响。重要的是要强调, 增长是一个复杂和复杂的生物过程;因此, 该方法的初步数据必须通过定量的氧消耗和发酵副产物的积累来证实。因此, 这种技术可以作为初步筛选的化合物/物质, 可能扰乱或提高发酵或呼吸代谢。

酿酒酵母的生长已成为识别许多生理和分子机制的宝贵工具。增长主要用三种方法来衡量: 现场测试的串行稀释、集落单元计数和生长曲线。这些技术可以单独使用或结合各种基质、环境条件、突变体和化学物质来调查特定的反应或表型。

线粒体呼吸是一个生物过程中, 生长动力学已成功地应用于发现未知机制。在这种情况下, 补充的增长媒体与非可发酵的碳源, 如甘油, 乳酸, 或乙醇 (这是完全代谢的线粒体呼吸), 作为唯一的碳和能源的来源, 可以评估呼吸生长是检测氧化磷酸化活性¹的扰动的重要因素。另一方面, 用生长动力学模型来破译发酵后的机理是很复杂的。

对发酵和线粒体呼吸的研究对于阐明某些表型的分子机制, 如 Crabtree 和华宝效应^2,3至关重要。Crabtree 效应的特点是酵通量增加, 线粒体呼吸抑制, 并建立发酵为主要途径生成 ATP 的存在高浓度的可发酵碳水化合物 (>0.8 毫米)^4,5。华宝效应是代谢模拟到 Crabtree 效应, 不同的是, 在哺乳动物细胞, 发酵的主要产品是乳酸⁶....

1. 文化媒体和接种准备

1. 准备100毫升2% 酵母萃取物-蛋白胨-葡萄糖 (YPD) 液体培养基 (添加1克酵母萃取物, 2 克酪蛋白蛋白胨, 2 克葡萄糖到100毫升蒸馏水)。将3毫升的介质放入15毫升消毒锥形管中。在121摄氏度和 1.5 psi 的情况下, 将介质蒸压15分钟。
   注: 介质可存储至多一个月的4–8°c。
2. 用3毫升的凉无菌 2% YPD 汤和 250 ul 的酵母细胞, 在-20 摄氏度的甘油中保存一只锥形管接种.在30?.......

生长曲线可用于对酵母菌的呼吸和发酵表型进行初步判别。因此, 我们进行了不同的葡萄糖浓度的酵母(BY4742) 的批次培养, 这些都被报告为诱导发酵生长: 1%, 2% 和 10% (瓦特/v)⁹。显示发酵表型的文化有一个小的滞后阶段和一个指数阶段以高增长率 (图 1)。乙醇、甘油和乳酸是一种只有通过呼吸才能代谢的碳源;因此, 我们使.......

自从 j. Monod¹⁰表示, 对细菌培养的研究是微生物学的基本方法, 已经过去了很长一段时间。分子工具的出现延缓了生长作为一种技术的使用和研究。尽管增长的复杂性涉及许多相互关联的过程, 但它的基本机制可以用数学模型¹¹来描述。这是一个健壮的方法, 可作为一个补充工具, 以阐明最复杂的分子机制¹²。

要获得此方法的?.......

这一项目得到了委员会 Ciencia y Tecnología (赠款号 293940) 和基金会 TELMEX-TELCEL (赠款号 162005585) 的赠款的支助, 两者都是 IKOM。