Saccharomyces cerevisiae Eksponentiel vækst kinetik i Batch kultur til at analysere respiratorisk og Fermentativ stofskifte

Her præsenterer vi en protokol for at anslå den respiratoriske og Fermentativ metabolisme ved at montere den eksponentielle vækst af Saccharomyces cerevisiae eksponentiel vækst ligningen. Beregning af de kinetiske parametre giver mulighed for screening af påvirkninger af stoffer/forbindelser på gæring eller mitokondrie respiration.

Saccharomyces cerevisiae celler i den eksponentielle fase opretholde deres vækst ved at producere ATP gennem gæring og/eller mitokondrie respiration. Gæringsdygtigt CO2 koncentration regulerer hovedsagelig, hvordan gærcellen generere ATP; således, variation i fermenterbare kulhydrater niveauer drev S. cerevisiaeenergiske metabolisme. Dette papir beskriver en høj overførselshastighed metode baseret på eksponentiel gær vækst til at vurdere virkningerne af koncentration og arten af kulstof kilde på luftvejene og Fermentativ stofskifte. Vækst af S. cerevisiae er målt i en mikrotiterplade eller rystet konisk kolbe ved at bestemme det optisk densitet (OD) på 600 nm. Derefter, en vækstkurven er bygget af plotting OD versus tid, hvilket giver mulighed for identifikation og udvælgelse af den eksponentielle fase, og er udstyret med eksponentiel vækst ligning at opnå kinetiske parametre. Lav-specifik tilvækst med højere fordobling gange generelt repræsenterer en respiratorisk vækst. Omvendt, højere-specifik tilvækst med lavere fordobling gange angive Fermentativ vækst. Tærskelværdier for fordobling tid og specifikke vækstrate estimeres ved hjælp af velkendte respiratorisk eller Fermentativ betingelser, såsom ikke-fermenterbare carbon kilder eller højere koncentrationer af Gæringsdygtigt sukker. Dette er opnået for hver specifikke stamme. Endelig, de beregnede kinetiske parametre er sammenlignet med tærskelværdier at etablere om gæren viser Fermentativ og/eller respiratorisk vækst. Fordelen ved denne metode er dens relative enkelhed for forstå virkningerne af et stof/sammensat på Fermentativ eller respiratoriske stofskifte. Det er vigtigt at fremhæve, at vækst er en indviklede og komplekse biologiske proces; Derfor, foreløbige data fra denne metode skal være bekræftet af kvantificeringen af iltforbrug og ophobning af gæring biprodukter. Derved kan denne teknik bruges som en indledende screening af forbindelser/stoffer, der kan forstyrre eller forbedrer Fermentativ eller respiratoriske stofskifte.

Saccharomyces cerevisiae vækst har fungeret som et værdifuldt redskab til at identificere snesevis af fysiologiske og molekylære mekanismer. Vækst måles primært af tre metoder: serielle fortyndinger for spot test, kolonidannende enhed optælling og vækstkurver. Disse teknikker kan bruges alene eller i kombination med en bred vifte af substrater, miljøforhold, mutanter og kemikalier til at undersøge konkrete svar eller fænotyper.

Mitokondrie respiration er en biologisk proces, hvor vækst kinetik har været anvendt med succes til at opdage ukendte mekanismer. I dette tilfælde tilskud af vækst medier med ikke-fermenterbare carbon kilder....

1. dyrkningsmedier og inokulum forberedelse

1. Forberede 100 mL 2% gær extract-pepton-dextrose (YPD) flydende medium (tilføje 1 g gær extract, 2 g af kasein pepton, og 2 g af glukose til 100 mL med destilleret vand). Dispensere 3 mL af medierne i 15 mL steriliserbar koniske rør. Autoklave medier i 15 min ved 121 ° C og 1,5 psi.
   Bemærk: Medierne kan opbevares i op til en måned på 4-8 ° C.
2. Podes en koniske rør fyldt med 3 mL af cool sterile 2% YPD bouillon med 250 μL af S. cerevisiae.......

Vækstkurver kan bruges til foreløbigt forskelsbehandle respiratorisk og Fermentativ fænotyper i S. cerevisiae gær. Derfor, vi udføres batch kulturer af S. cerevisiae (BY4742) med forskellige glucose koncentrationer, der er blevet rapporteret til at fremkalde Fermentativ vækst: 1%, 2% og 10% (w/v)⁹. Kulturer viser et Fermentativ fænotype har en lille forsinkelse og en eksponentiel fase med en høj vækstrate (figur 1

Har gået lang tid, da J. Monod¹⁰ gav udtryk for, at undersøgelsen af vækst af bakterielle kulturer er den grundlæggende metode til mikrobiologi. Fremkomsten af de molekylære værktøjer forsinkelser skik og undersøgelse af vækst som en teknik. På trods af kompleksiteten af vækst, som involverer mange indbyrdes forbundne processer, kan dens underliggende mekanismer beskrives ved hjælp af matematiske modeller¹¹. Dette er en robust tilgang, der kan bruges som et supp.......

Dette projekt blev støttet af tilskud af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant nummer 293940) og Fundación TELMEX-TELCEL (grant nummer 162005585), begge til IKOM.