Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.

Saccharomyces cerevisiae cellen in de exponentiële fase groei hun wordt aangewezen door het produceren van ATP door middel van fermentatie en/of mitochondriaal ademhaling. De fermenteerbare koolstofconcentratie regelt voornamelijk hoe de gistcellen genereren ATP; Dus, de variatie in fermenteerbare koolhydraten niveaus rijdt de energetische stofwisseling van S. cerevisiae. Dit witboek beschrijft een methode van de high-throughput gebaseerd op exponentiële gist groei te schatten van de effecten van veranderingen van de concentratie en de aard van de koolstofbron op ademhalings- en fermenterende metabolisme. De groei van S. cerevisiae is gemeten in een microplate of geschud conische kolf door bepaling van de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Vervolgens is een groeicurve gebouwd door plotting OD tegen de tijd, waardoor identificatie en selectie van de exponentiële fase, en is uitgerust met de vergelijking van exponentiële groei te verkrijgen van de kinetische parameters. Lage specifieke groeisnelheden met hogere verdubbeling keer vertegenwoordigen in het algemeen een respiratoire groei. Daarentegen geven hogere specifieke groeisnelheden met lagere verdubbeling keer fermenterende groei. Drempelwaarden van een verdubbeling van de tijd en de specifieke groeisnelheid worden geschat met behulp van bekende respiratoire of fermenterende aandoeningen, zoals niet-fermenteerbare koolstof bronnen of hogere concentraties van fermenteerbare suikers. Dit percentage wordt verkregen voor elke specifieke soort. Tot slot worden de berekende kinetische parameters vergeleken met de drempelwaarden vast te stellen of de gist fermenterende en/of respiratoire groei toont. Het voordeel van deze methode is de relatieve eenvoud voor inzicht in de effecten van een stof/samengestelde op fermenterende of luchtwegen metabolisme. Het is belangrijk om te benadrukken dat groei een ingewikkelde en complexe biologische proces is; Daarom moet de voorlopige gegevens van deze methode worden bevestigd door de kwantificering van zuurstofverbruik en accumulatie van bijproducten van gisting. Daarmee is deze techniek kan worden gebruikt als een oriënterende van verbindingen/stoffen die kunnen storen of verbetering van fermenterende of luchtwegen metabolisme.

Saccharomyces cerevisiae groei heeft gediend als een waardevol instrument te identificeren van tientallen fysiologische en moleculaire mechanismen. Groei is gemeten voornamelijk op drie manieren: seriële verdunningen voor ter plaatse testen, kolonie-vormende unit tellen en groeikrommes. Deze technieken kunnen alleen of in combinatie met een verscheidenheid aan substraten, omgevingsfactoren, mutanten en chemicaliën te onderzoeken specifieke antwoorden of fenotypen worden gebruikt.

Mitochondriale ademhaling is een biologisch proces waarin groei kinetiek met succes toegepast is voor het ontdekken van onbekende mechanismen. In dit geva....

1. cultuurmedia en entmateriaal voorbereiding

1. Bereiden van 100 mL vloeibare voedingsbodem van 2% gist extract-pepton-dextrose (YPD) (1 g gist extract, caseïne pepton, 2 g en 2 g glucose aan 100 mL gedestilleerd water toevoegen). Breng 3 mL van de media in 15 mL steriliseerbare conische buizen. Autoclaaf de media gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C en 1,5 psi.
   Opmerking: De media kunnen worden opgeslagen voor maximaal een maand bij 4-8 ° C.
2. Inoculeer een conische buis gevuld met 3 mL cool ster.......

Groeikrommes kunnen worden gebruikt om preliminair discrimineren tussen ademhalings- en fermenterende fenotypen in de S. cerevisiae gist. Dus we batch culturen van S. cerevisiae (BY4742) uitgevoerd met verschillende glucose concentraties die zijn gemeld voor het opwekken van fermenterende groei: 1%, 2% en 10% (m/v)⁹. Culturen waaruit een fermenterende fenotype hebben een kleine vertraging-fase en een exponentiële fase met een hoog groeipercentage.......

Een lange tijd verstreken is sinds J. Monod¹⁰ uitgedrukt dat de studie van de groei van bacteriële culturen de basismethode van de microbiologie is. De komst van de moleculaire tools vertraagt het gebruik en de studie van de groei als een techniek. Ondanks de complexiteit van groei, waarbij tal van onderling samenhangende processen, kunnen de onderliggende mechanismen worden beschreven met behulp van wiskundige modellen¹¹. Dit is een robuuste benadering die kan worden gebr.......

Dit project werd gesteund door subsidies van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (subsidie nummer 293940) en Fundación TELMEX-TELCEL (subsidie nummer 162005585), zowel IKOM.