Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.
שמר האפייה תאים בשלב מעריכי לקיים את הצמיחה שלהם על-ידי הפקת ATP באמצעות תסיסה ו/או מיטוכונדריאלי נשימה. ריכוז פחמן בהתססה של מושל בעיקר איך תאי השמרים מייצרים ATP; לפיכך, הוריאציה ברמות פחמימות בהתססה של כוננים חילוף החומרים האנרגטי של cerevisiae ס. מאמר זה מתאר שיטה תפוקה גבוהה המבוססת על צמיחת שמרים מעריכי כדי להעריך את ההשפעות של שינויי ריכוז והטבע של מקור פחמן על חילוף החומרים הנשימה ואת fermentative. הצמיחה של cerevisiae נמדד microplate או מנוער חרוט הבקבוק על-ידי קביעת הצפיפות האופטית (OD)-600 ננומטר. לאחר מכן, עקומת גדילה זה נבנה על ידי OD ההתוויה נגד הזמן, אשר מאפשרת זיהוי ובחירה של שלב מעריכית, והוא מצויד עם המשוואה הגידול האקספוננציאלי לקבל פרמטרים קינטי. שיעורי צמיחה ספציפיים נמוך עם גבוה יותר פעמים ההכפלה בדרך כלל מייצגים גידול בדרכי הנשימה. לעומת זאת, שיעור צמיחה ספציפיים גבוה עם התחתון פעמים ההכפלה מצביעים על צמיחה fermentative. ערכי הסף של הכפלת זמן ושיעור צמיחה ספציפיים מוערך באמצעות מחלות בדרכי הנשימה או fermentative ידועים, כמו פחמן בהתססה של מקורות או ריכוז גבוה של סוכרים בהתססה. זה מתקבל עבור כל זן ספציפי. לבסוף, הפרמטרים קינטי מחושב מושווים עם ערכי סף כדי לקבוע אם השמרים מציגה צמיחה fermentative ו/או בדרכי הנשימה. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות היחסית להבנת השפעת תרכובת/חומר על חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה. חשוב להדגיש כי הצמיחה היא תהליך ביולוגי מסובכים ומורכבים; לכן, המידע הראשוני של שיטה זו חייבת להיות שחלקית כימות של צריכת החמצן והצטברות תוצרי לוואי תסיסה. ובכך, טכניקה זו יכולה לשמש הקרנה ראשוני של תרכובות/חומרים אשר עשויים להפריע או לשפר את חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה.
שמר האפייה צמיחה שימש כלי חשוב כדי לזהות עשרות מנגנונים פיזיולוגיים ומולקולרית. צמיחה נמדד בעיקר על ידי שלוש שיטות: טורי דילולים בדיקות ספוט, המושבה יוצרי יחידת ספירה של עקומות גדילה. שיטות אלה ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם מגוון רחב של סובסטרטים, תנאים סביבתיים, מוטציות, כימיקלים לחקור תגובות ספציפיות או פנוטיפים.
נשימה מיטוכונדריאלי היא תהליך ביולוגי שבו קינטיקה גידול יושם בהצלחה על גילוי מנגנוני לא ידוע. במקרה זה, תוספת של צמיחה מדיה עם פחמן בהתססה של מקורות כגון גליצרול, לקטאט או אתנול (אשר הם מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי), כמו המקור פחמן ואנרגיה הבלעדי מאפשר להעריך הצמיחה בדרכי הנשימה, וזה חשוב. לזהות לפליטת ....
1. תרבות המדיה והכנות Inoculum
עקומות גדילה יכול לשמש preliminarily להפלות בין פנוטיפים הנשימה ו fermentative ב ס cerevisiae השמרים. לכן, ביצענו תרבויות אצווה של cerevisiae ס (BY4742) עם ריכוזי גלוקוז שונים דווח כי כדי לגרום לצמיחה fermentative: 1%, 2% ו- 10% (w/v)9. תרבויות מציג הפנוטיפ fermentative שלב פיגור קטן ויש שלב מערי.......
זמן רב עבר מאז ומונו ג'10 הביעו כי המחקר של הצמיחה של חיידקים תרבויות היא השיטה הבסיסית של מיקרוביולוגיה. כניסתו של הכלים מולקולרית מעכב את השימוש והלימוד של הגידול כמו טכניקה. למרות המורכבות של צמיחה אשר מערבת תהליכים לתקצב רבים, מנגנוני הבסיסית שלה יכולה להיות מתוארת באמצעות.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved