Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Qui presentiamo un protocollo per stimare il metabolismo respiratorio e fermentativo inserendo la crescita esponenziale di Saccharomyces cerevisiae per l'equazione di crescita esponenziale. Calcolo dei parametri cinetici permette per lo screening delle influenze di sostanze/composti sulla fermentazione o respirazione mitocondriale.

Cellule di Saccharomyces cerevisiae nella fase esponenziale sostengono la loro crescita con la produzione di ATP attraverso la fermentazione e/o respirazione mitocondriale. La concentrazione di carbonio fermentabili governa principalmente come le cellule di lievito generano ATP; così, la variazione nei livelli di carboidrati fermentescibili guida il metabolismo energetico di S. cerevisiae. Questo documento descrive un metodo di alto-rendimento basato su una crescita esponenziale lievito per stimare gli effetti delle variazioni di concentrazione e la natura della fonte di carbonio sul metabolismo fermentativo e respiratorio. La crescita di S. cerevisiae è misurata in una micropiastra o scossa conica boccetta determinando la densità ottica (OD) a 600 nm. Quindi, una curva di crescita è costruita da tracciato OD rispetto al tempo, che permette l'identificazione e la selezione della fase esponenziale ed è dotato con l'equazione di crescita esponenziale per ottenere parametri cinetici. Bassi tassi di crescita specifici con tempi di raddoppiamento superiori rappresentano generalmente una crescita delle vie respiratorie. Al contrario, tassi di crescita specifici superiori con tempi di raddoppiamento inferiori indicano crescita fermentativo. Valori di soglia di raddoppiare il tempo e il tasso di crescita specifico sono stimati utilizzando il ben note condizioni respiratorie o fermentative, come fonti di carbonio non fermentabili o più alte concentrazioni di zuccheri fermentescibili. Questo è ottenuto per ogni ceppo specifico. Infine, i parametri cinetici calcolati vengono confrontati con i valori di soglia per stabilire se il lievito Mostra una crescita fermentativa e/o respiratoria. Il vantaggio di questo metodo è la sua relativa semplicità per la comprensione degli effetti di un sostanza/composto sul metabolismo fermentativo o respiratorio. È importante sottolineare che la crescita è un processo biologico complesso e intricato; Pertanto, i dati preliminari da questo metodo devono essere corroborati dalla quantificazione del consumo di ossigeno e accumulazione dei sottoprodotti della fermentazione. Quindi, questa tecnica può essere utilizzata come uno screening preliminare di composti/sostanze che possono disturbare o migliorare il metabolismo fermentativo o respiratorio.

Crescita di Saccharomyces cerevisiae ha servito come uno strumento prezioso per identificare decine di meccanismi fisiologici e molecolari. La crescita è misurata principalmente in tre modi: diluizioni seriali per spot test, unità formanti colonie contando e curve di crescita. Queste tecniche utilizzabile da solo o in combinazione con una varietà di substrati, condizioni ambientali, mutanti e prodotti chimici per esaminare le risposte specifiche o fenotipi.

La respirazione mitocondriale è un processo biologico in cui cinetica di crescita è stato applicato con successo per scoprire i meccanismi sconosciuti. In questo caso, il comple....

1. terreni di coltura e preparazione dell'inoculo

1. Preparare 100 mL di terreno liquido 2% lievito estratto-peptone-destrosio (YPD) (aggiungere 1 g di lievito estratto, 2 g di peptone di caseina, e 2 g di glucosio per 100 mL di acqua distillata). Versare 3 mL dei media in provette coniche da 15 mL sterilizzabile. Sterilizzare in autoclave i media per 15 min a 121 ° C e 1,5 psi.
   Nota: I media possono essere memorizzati fino ad un mese a 4 – 8 ° C.
2. Inoculare un tubo conico riempito con 3 mL di brod.......

Curve di crescita possono essere utilizzate per discriminare preliminarmente tra fenotipi respiratori e fermentativi del lievito S. cerevisiae . Di conseguenza, abbiamo effettuato batch colture di S. cerevisiae (BY4742) con le concentrazioni di glucosio differenti che sono state segnalate per indurre la crescita fermentativo: 1%, 2% e 10% (p/v)⁹. Culture che mostra un fenotipo fermentativo hanno una piccolo lag fase e una fase esponenziale con un .......

Molto tempo è passato da quando J. Monod¹⁰ espresso che lo studio della crescita delle colture batteriche è il metodo di base di microbiologia. L'avvento degli strumenti molecolari ritarda l'utilizzo e lo studio della crescita come tecnica. Nonostante la complessità della crescita che coinvolge numerosi processi interconnessi, suoi meccanismi di fondo possono essere descritto utilizzando modelli matematici¹¹. Si tratta di un approccio robusto che può essere utilizzato c.......

Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (concessione numero 293940) e Fundación TELMEX-TELCEL (concessione numero 162005585), entrambi a IKOM.