Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Aqui nós apresentamos um protocolo para estimar o metabolismo respiratório e fermentativa por encaixe o crescimento exponencial de Saccharomyces cerevisiae para a equação de crescimento exponencial. Cálculo dos parâmetros cinéticos permite o rastreio das influências de substâncias/compostos na fermentação ou respiração mitocondrial.
Células de Saccharomyces cerevisiae na fase exponencial sustentam seu crescimento através da produção de ATP através de fermentação e/ou respiração mitocondrial. A concentração de carbono fermentáveis rege principalmente como as células de levedura geram ATP; assim, a variação nos níveis de carboidratos fermentáveis impulsiona o metabolismo energético de S. cerevisiae. Este documento descreve um método de alta produtividade com base no crescimento exponencial de levedura para estimar os efeitos de alterações de concentração e natureza da fonte de carbono no metabolismo respiratório e fermentação. O crescimento de S. cerevisiae é medido em uma microplaca ou abalado cónico balão através da determinação da densidade óptica (OD) em 600 nm. Então, uma curva de crescimento é construída por plotagem OD versus tempo, que permite a identificação e seleção da fase exponencial e é equipado com a equação de crescimento exponencial para obter parâmetros cinéticos. Taxas de crescimento específico baixo com maiores tempos de duplicação geralmente representam um crescimento respiratório. Por outro lado, maiores taxas de crescimento com baixas vezes dobrando indicam crescimento fermentativa. Estimam-se valores de limite de tempo de duplicação da taxa de crescimento específico usando condições respiratórias ou fermentativa bem conhecidas, como fontes de carbono não-açúcares fermentáveis ou altas concentrações de açúcares fermentáveis. Isto é obtido para cada microrganismo específico. Finalmente, os parâmetros cinéticos calculados são comparados com os valores de limiar para estabelecer se a levedura apresenta crescimento fermentativa e/ou respiratório. A vantagem desse método é sua relativa simplicidade para entender os efeitos de um substância/composto no metabolismo fermentativa ou respiratório. É importante salientar que o crescimento é um complexo e intrincado processo biológico; Portanto, dados preliminares deste método devem ser corroborados pela quantificação do consumo de oxigênio e acúmulo de subprodutos da fermentação. Desse modo, esta técnica pode ser usada como uma triagem preliminar de compostos/substâncias que podem perturbar ou realce o metabolismo fermentativa ou respiratório.
Crescimento de Saccharomyces cerevisiae tem servido como uma valiosa ferramenta para identificar dezenas de mecanismos fisiológicos e moleculares. Crescimento é medido principalmente por três métodos: diluições em série para testes, unidades formadoras de colônia contando e curvas de crescimento. Estas técnicas podem ser usadas isoladamente ou em combinação com uma variedade de substratos, condições ambientais, mutantes e produtos químicos para investigar respostas específicas ou fenótipos.
Respiração mitocondrial é um processo biológico em que cinética de crescimento tem sido aplicada com sucesso para descobrir mecanismos desconhe....
1. meios de cultura e preparação do inóculo
Curvas de crescimento podem ser usadas para preliminarmente discriminar entre fenótipos respiratórios e fermentativa em levedura S. cerevisiae . Portanto, foram realizadas culturas de lote de S. cerevisiae (BY4742) com concentrações diferentes de glicose que foram relatadas para induzir o crescimento de fermentação: 1%, 2% e 10% (p/v)9. Mostrando um fenótipo fermentativa de culturas têm uma fase de pequeno lag e uma fase exponencial com um.......
Muito tempo se passou desde que J. Monod10 expressa que o estudo do crescimento de culturas bacterianas é o método básico de microbiologia. O advento das ferramentas moleculares atrasa o uso e o estudo do crescimento como uma técnica. Apesar da complexidade de crescimento que envolve inúmeros processos inter-relacionados, seus mecanismos subjacentes podem ser descritos usando modelos matemáticos11. Esta é uma abordagem robusta que pode ser usada como uma ferramenta c.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
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