Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Aquí presentamos un protocolo para estimar el metabolismo respiratorio y fermentativo encajando el exponencial crecimiento de Saccharomyces cerevisiae a la ecuación de crecimiento exponencial. Cálculo de los parámetros cinéticos permite la proyección de la influencia de compuestos de sustancias en fermentación o respiración mitocondrial.
Las células de Saccharomyces cerevisiae en la fase exponencial sostienen su crecimiento mediante la producción de ATP por fermentación o respiración mitocondrial. La concentración de carbono fermentables principalmente gobierna cómo las células de levadura generan ATP; por lo tanto, la variación en los niveles de carbohidratos fermentables impulsa el metabolismo energético de S. cerevisiae. Este papel describe un método de alto rendimiento basado en el crecimiento exponencial de la levadura para estimar los efectos de los cambios de la concentración y naturaleza de la fuente de carbono sobre el metabolismo respiratorio y fermentativo. El crecimiento de S. cerevisiae es medido en una microplaca o sacudirse cónico matraz mediante la determinación de la densidad óptica (OD) a 600 nm. Entonces, una curva de crecimiento es construida por OD trazado frente al tiempo, que permite la identificación y selección de la fase exponencial y está equipado con la ecuación de crecimiento exponencial para obtener parámetros cinéticos. Las tasas de crecimiento bajo con tiempos de duplicación superiores generalmente representan un crecimiento respiratorio. Por el contrario, mayores tasas de crecimiento específico con menores tiempos de duplicación indican crecimiento fermentativo. Valores umbral de duplicar el tiempo y la tasa de crecimiento específico se calculan usando condiciones respiratorias o fermentativas bien conocidas, tales como fuentes de carbono no fermentables o altas concentraciones de azúcares fermentables. Esto se obtiene de cada cepa específica. Por último, los parámetros cinéticos calculados se comparan con los valores de umbral para establecer si la levadura demuestra crecimiento fermentativo o respiratorio. La ventaja de este método es su relativa sencillez para la comprensión de los efectos de un compuesto de sustancia en el metabolismo fermentativo o respiratorio. Es importante destacar que el crecimiento es un proceso intrincado y complejo biológico; por lo tanto, los datos preliminares de este método deben ser corroborados por la cuantificación del consumo de oxígeno y la acumulación de subproductos de la fermentación. Por lo tanto, esta técnica puede utilizarse como una proyección preliminar de compuestos/sustancias que pueden alterar o mejorar el metabolismo fermentativo o respiratorio.
Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ha servido como una herramienta valiosa para identificar decenas de mecanismos fisiológicos y moleculares. Crecimiento se mide principalmente por tres métodos: diluciones seriadas para pruebas de punto, unidad formadora de colonias contando y las curvas de crecimiento. Estas técnicas se pueden utilizar solo o en combinación con una variedad de sustratos, condiciones ambientales, mutantes y productos químicos para investigar las respuestas específicas o fenotipos.
La respiración mitocondrial es un proceso biológico en el cual cinética de crecimiento se ha aplicado con éxito para descubrir meca....
1. medios de cultivo y preparación del inóculo
Las curvas de crecimiento pueden utilizarse para diferenciar preliminarmente los fenotipos respiratorios y fermentativos de la levadura S. cerevisiae . Por lo tanto, se realizaron cultivos batch de S. cerevisiae (BY4742) con concentraciones diferentes de glucosa que se han divulgado para inducir el crecimiento fermentativo: 1%, 2% y 10% (w/v)9. Las culturas que muestran un fenotipo fermentativo tienen un pequeño retraso y una fase exponencial con.......
Mucho tiempo ha pasado desde que J. Monod10 expresa que el estudio del crecimiento de cultivos bacterianos es el método básico de la microbiología. El advenimiento de las herramientas moleculares retrasa el uso y el estudio del crecimiento como una técnica. A pesar de la complejidad de crecimiento que involucra numerosos procesos relacionados entre sí, sus mecanismos subyacentes pueden describirse mediante el uso de modelos matemáticos11. Se trata de un enfoque robust.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
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