Saccharomyces cerevisiae Exponentiell tillväxt Kinetics i Batch kultur att analysera respiratoriska och fermentativa Metabolism

Här presenterar vi ett protokoll för att uppskatta respiratoriska och fermentativa ämnesomsättningen genom att montera den exponentiella tillväxten av Saccharomyces cerevisiae till ekvationen exponentiell tillväxt. Beräkning av de kinetiska parametrarna tillåter för screening av påverkan av ämnen/föreningar på jäsning eller mitokondrie andning.

Saccharomyces cerevisiae celler i den exponentiella fasen upprätthålla sin tillväxt genom att producera ATP genom jäsning och/eller mitokondrie respiration. Jäsbara kolhalten reglerar främst hur jästceller generera ATP; Således driver variationen i jäsbara kolhydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Detta dokument beskriver en hög genomströmning metod baserad på exponentiell jäst tillväxt att uppskatta effekterna av koncentrationen förändringar och naturen av kol källan på andningsorganen och fermentativa metabolism. Tillväxten av S. cerevisiae är mätt i en mikroplattan eller skakas koniska kolven genom bestämning av den optiska densiteten (OD) på 600 nm. Sedan byggs en tillväxtkurva genom plotting OD kontra tid, vilket gör att identifiering och val av den exponentiella fasen, och är utrustad med exponentiell ekvation att få kinetiska parametrar. Låg specifik tillväxt med högre fördubbling gånger representerar vanligtvis en respiratorisk tillväxt. Däremot indikerar högre specifik tillväxt med lägre fördubbling gånger fermentativa tillväxt. Tröskelvärden för fördubbling tid och tillväxthastighet är beräknat med välkända luftvägs- eller fermentativa villkor, såsom icke-jäsbara kolkällor eller högre koncentrationer av jäsbara sockerarter. Detta erhålls för varje specifik stam. Slutligen, de beräknade kinetiska parametrarna jämförs med tröskelvärdena att fastställa huruvida jästen visar fermentativa eller respiratorisk tillväxt. Fördelen med denna metod är dess relativa enkelhet för att förstå effekterna av en substans/förening på fermentativa eller respiratorisk metabolism. Det är viktigt att betona att tillväxt är en invecklad och komplicerad biologisk process. preliminära data från denna metod måste därför styrkas genom kvantifiering av syreförbrukning och ackumulering av jäsning biprodukter. Därmed, kan denna teknik användas som en preliminär genomgång av föreningar/ämnen som kan störa eller förbättra fermentativa eller respiratorisk metabolism.

Saccharomyces cerevisiae tillväxt har fungerat som ett värdefullt verktyg att identifiera dussintals fysiologiska och molekylära mekanismer. Tillväxt mäts primärt av tre metoder: seriespädningar för spot test, kolonibildande enhet räknar och tillväxtkurvor. Dessa tekniker kan användas ensamt eller i kombination med en mängd olika substrat, miljöförhållanden, mutanter och kemikalier för att undersöka specifika reaktioner eller fenotyper.

Mitokondriell andning är en biologisk process där tillväxt kinetik har tillämpats framgångsrikt för att upptäcka okända mekanismer. I detta fall komplettering tillväxt medier med icke-jäsbara kol kä....

1. kultur Media och inokulum förberedelse

1. Bereda 100 mL 2% jäst extrakt-pepton-dextros (YPD) flytande medium (lägga 1 g jäst extrakt, kaseinpepton, 2 g och 2 g glukos till 100 mL destillerat vatten). Fördela 3 mL av media i 15 mL steriliserbar koniska rör. Autoklav media under 15 minuter vid 121 ° C och 1,5 psi.
   Obs: Media kan förvaras i upp till en månad vid 4 – 8 ° C.
2. Inokulera ett koniskt rör fyllda med 3 mL cool steril 2% YPD buljong med 250 μL av S. cerevisiae celler bev.......

Tillväxtkurvorna kan användas för att preliminärt diskriminera respiratoriska och fermentativa fenotyper i S. cerevisiae jästen. Därför vi utfört batch kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med olika glukos koncentrationer som har rapporterats inducera fermentativa tillväxt: 1%, 2% och 10% (w/v)⁹. Kulturer visar en fermentativa fenotyp har en liten fördröjning och en exponentiell fas med en hög tillväxttakt (figur 1<.......

Lång tid har gått sedan J. Monod¹⁰ uttryckt att studiet av tillväxten av bakteriekulturer är den grundläggande metoden för mikrobiologi. Tillkomsten av de molekylära verktyg förseningar-användning och studie av tillväxten som en teknik. Trots komplexiteten i tillväxt vilket innebär många inbördes relaterade processer, kan dess underliggande mekanismer beskrivas med hjälp av matematiska modeller¹¹. Detta är en robust metod som kan användas som ett kompletter.......

Projektet stöddes av bidrag av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (licensnummer 293940) och Fundación TELMEX-TELCEL (licensnummer 162005585), både till IKOM.