1. generation af kationiske Nanoliposomes (figur 1)
<ol><li>Opløse lipider DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hydrochlorid) og DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamin), leveres som et pulver i chloroform at opnå en endelig koncentration på 25 mg/mL. Bemærk: Gemme de opløste lipider ved-20 ° C.</li>
	<li>Arbejde med 25 mg/mL stamopløsning af både lipider. Mix 40 µL af den opløste DC-kolesterol og 80 µL af den opløste DOPE i et glas kolb...

Den præsenterede protokol beskriver generation af NLps med høj indkapsling effekten for syntetisk modificerede mRNA, samt den pålidelige Transfektion af celler i vitro. Desuden, NLps sikre frigivelsen af mRNA, som til gengæld er oversat til en funktionel proteiner inde i cellerne. Derudover transfections ved hjælp af NLps kan udføres i regelmæssig celle medium, resulterer i høj celle viabilities under Transfektion, og vare op til tre dage efter Transfektion.
For at bruge mRNA ...

Brug af modificerede mRNA for terapeutisk anvendelse har vist stort potentiale i de sidste par år. I hjerte-kar-, provokerende og monogenetic sygdomme, samt i udviklingen af vacciner, er mRNA en lovende terapeutisk agent1.
Protein substitutionsterapi med mRNA tilbyder flere fordele i forhold til den klassiske genterapi, som er baseret på DNA Transfektion i target celler2. Funktionen mRNA indleder direkte i cytosol. Selvom plasmid DNA (pDNA), en konstruktion af dobbelt-strenget, cirkulært kan DNA indeholdende en promotor-regionen og en gensekvens, kodning den terapeutiske protein3, også handlinger i cytosol, det kun indgå i celler, som går gennem mitosen på tidspunktet for Transfektion. Dette reducerer antallet af transfekteret celler i væv1,4. Specifikt er Transfektion af væv med svag mitose aktivitet, såsom hjerte celler, vanskeligt5. I modsætning til pDNA forekomme Transfektion og oversættelse af mRNA i mitotiske og ikke-mitotiske celler i væv1,6. Viral integration af DNA i host-genom kan komme med mutagene virkninger eller immun reaktioner7,8, men efter Transfektion af celler med en protein-kodning mRNA, de novo -syntesen af det ønskede protein starter autonomt9,10. Derudover kan proteinsyntese justeres præcist til patientens behov gennem individuelle doser, uden at gribe ind i genomet og risikere mutagene virkninger11. Den immun aktivering potentiale af syntetisk genererede mRNA kunne sænkes drastisk ved hjælp af pseudo-uridine og 5'-methylcytidine i stedet for uridine og cytidine12. Pseudo-uridine modificerede mRNA har også vist sig at have en øget biologiske stabilitet og en betydeligt højere translationel kapacitet13.
For at kunne drage fordel af de lovende egenskaber af mRNA-baseret terapi i kliniske anvendelser, er det vigtigt at skabe et passende køretøj til transport af mRNA ind i cellen. Dette køretøj skal være forsynet med ikke-toksiske egenskaber i in vitro og i vivo, beskytte mRNA mod nukleasen-nedbrydning og give tilstrækkelig cellulære optagelse for en langvarig ledighed og oversættelse af mRNA14.
Blandt alle mulige carrier typer for i vivo drug delivery, såsom kulstof-nanorør, quantum dots og Liposomer, sidstnævnte har været studeret mest15,16. Liposomer er vesikler bestående af en lipid tolagede10. De er amphiphilic med en hydrofob og en hydrofil sektion, og gennem selvstændig ordningen af disse molekyler, en sfærisk dobbelt lag er dannet17. Inde i Liposomer, kan terapeutiske agenter eller narkotika være indkapslet og dermed beskyttet mod Enzymatisk nedbrydning18. Liposomer som indeholder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chlorid (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, og dioctadecylamidoglycylspermine (hunde)21, eller DC-kolesterol22, er godt præget og ofte benyttes til cellulære Transfektion med DNA eller RNA.
Kationiske Liposomer består af et positivt ladede lipid og et tomt phospholipid23. Transfektion via kationiske Liposomer er en af de mest almindelige metoder til transport af nukleinsyrer i celler24,25. Kationiske lipid partikler danner komplekser med negativt ladede fosfat-grupper i rygraden i nukleinsyre molekyler26. Disse såkaldte lipoplexes tillægger overfladen af cellemembranen og komme ind i cellen via endocytose eller endocytose-lignende-mekanismer27.
I 1989, Malone mfl. korrekt beskrevet kationiske lipid-medieret mRNA Transfektion28. Men ved hjælp af en blanding af DOTMA og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), gruppen fandt at DOTMA manifesteret cytotoksiske virkninger28. Derudover viste Zohra et al. , at DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumformiat-propan chlorid) kan bruges som et mRNA Transfektion reagens29. For den effektive Transfektion af celler, bør DOTAP anvendes i kombination med andre reagenser, såsom fibronektin29 eller DOPE30. Hidtil har var DOTMA den første kationiske lipid på markedet anvendes til gen levering31. Andre lipider er brugt som terapeutisk luftfartsselskaber eller testes i forskellige stadier af kliniske forsøg, (f.eks. EndoTAG-I, som indeholder DOTAP som lipid transportør), undersøges i øjeblikket i et fase II kliniske forsøg32.
Dette arbejde beskriver en protokol for generation af NLps indeholdende DC-kolesterol og DOPE. Denne metode er nem at udføre og giver mulighed for generation af NLps i forskellige størrelser. Det generelle mål med NLp generation ved hjælp af metoden tør-film er at skabe Liposomer til mRNA kompleks, således at effektiv og biokompatible celle Transfektion in vitro-14,33.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

Udviklingen af messenger RNA (mRNA)-baseret terapi til behandling af forskellige sygdomme bliver mere og mere vigtig på grund af positive egenskaber af in vitro transskriberet (IVT) mRNA. Ved hjælp af IVT mRNA, kan være fremkaldt de novo -syntesen af en ønskede protein uden ændring af målcellen fysiologiske tilstand. Derudover kan proteinsyntese styres netop på grund af forbigående effekten af IVT mRNA.
For den effektive Transfektion af celler, kan nanoliposomes (NLps) repræsenterer en sikker og effektiv levering køretøj for terapeutisk mRNA. Denne undersøgelse beskriver en protokol for at generere sikre og effektive kationiske NLps bestående af DC-kolesterol og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) som en levering vektor for IVT mRNA. NLps har en defineret størrelse, en homogen fordeling og en høj compleksering kapacitet og kan produceres ved hjælp af metoden tør-film. Desuden præsenterer vi forskellige testsystemer for at analysere deres kompleks og Transfektion efficacies ved hjælp af syntetiske forbedret grøn fluorescerende proteiner (eGFP) mRNA, samt deres effekt på cellernes levedygtighed. Samlet set giver præsenteres protokollen en effektiv og sikker tilgang til mRNA kompleks, som kan fremme og forbedre forvaltningen af terapeutiske mRNA.

Ved hjælp af protokollen som beskrevet, blev NLps bestående af lipider DC-kolesterol og DOPE udarbejdet ved hjælp af metoden tør-film (figur 1). Under forberedelsen viser nanoliposome løsning forskellige stadier i turbiditet (figur 2).
Indkapsling effekten af NLps kan derefter analyseres efter indkapsling af 1 µg for eGFP-kodning mRNA ved at analysere den gratis m...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA at JoVE.com

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation af kationiske Nanoliposomes til effektiv levering af In Vitro transskriberet Messenger RNA

Her beskriver vi en protokol for generation af kationiske nanoliposomes, som er baseret på metoden tør-film og kan bruges til sikker og effektiv levering af in vitro- transskriberet messenger RNA.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Denne protokol gør det muligt at udvikle sikre og effektive nanoliposomer, der kan bruges som transfektionskøretøjer til terapeutisk messenger RNA. Disse nanoliposomer letter mRNA-optagelse i celler, hvilket resulterer i øget proteinudsetrykniveauer uden at påvirke cellernes levedygtighed. Den største fordel ved denne teknik er hurtig og nem generering af stabile nanoliposomer med defineret størrelse og homogen fordeling.Desuden beskytter de det indkapslede mRNA mod nedbrydning og fører til langvarig oversættelse. Demonstration af proceduren vil være Antonia Link, en ph.d.-studerende fra vores laboratorium. For at begynde denne procedure, forberede lager løsninger til lipider, DC-kolesterol og DOPE ved at opløse hver i chloroform til en endelig koncentration på 25 mg pr. milliliter.Bland 40 mikroliter af det opløste DC-kolesterol med 80 mikroliter af den opløste DOPE i en glaskolbe. Fordampechloroform under en argon gas flow i 15 minutter. Dernæst fylde en eksiccator med silica gel.Anvend den åbne glaskolbe indeni og påfør et vakuum natten over for at sikre, at den resterende chloroform er fordampet. Den resulterende lipidfilm vil danne inde i glaskolben. Den næste dag, tilsæt en milliliter nuklease frit vand til at rehydrere lipid film.Og vortex suspensionen i 15 minutter. Ansender suspensionen i et sonikeringsbad i en time. Efter dette, samle mini ekstruder i henhold til producenternes instruktioner.Fyld en sprøjte med væskefjedringen, og placer den den ene side af ekstruderen. Anstæn skal du placere en tom sprøjte på den anden side. Tryk lipidspensioneringen gennem membranen fra den ene sprøjte til den anden ca. 20-25 gange for at ekstrudere suspensionen.Derefter opbevares nanoliposomerne i en glaskolbe ved fire grader Celsius, indtil de er klar til brug. Først tø den syntetiske mRNA på is. Vortex den frosne mRNA og derefter centrifuge det kort før åbning af røret.Derefter blandes et mikrogram af det syntetiske mRNA med forskellige mængder nanoliposomaffjedring. Centrifuge kort og inkubere ved stuetemperatur i 20 minutter for nanolipoplex dannelse. Derefter tilsættes milliliter af almindeligt cellemedie til nanolipoplex's og blandes ved pipettering op og ned.Forbered cellerne en dag før transfektion. Derfor plade 150, 000 A549 celler i hver brønd af en 12 brøndplade en dag før transfektion. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og almindelig cellemedium i 24 timer.Derefter næste dag, vaske hver brønd af forberedte celler én gang med en milliliter PBS. Der tilsættes en milliliter en forberedt nanolipoplex-blanding til en af brøndene, der indeholder A549-cellerne. Inkuber ved almindelige forhold i 24 timer for at analysere transfektionseffektiviteten eller i 24-72 timer for at analysere cellernes levedygtighed efter transfektion.Fjern supernatanten og vask hver brønd med en milliliter PBS for at fjerne de resterende nanoliposomer. For at forberede cellerne til cytometri, først tilføje 500 mikroliter af trypsin EDTA til hver brønd og inkubere ved 37 grader Celsius i tre minutter for at trypsinize cellerne. Dernæst tilsættes 500 mikroliter af almindeligT FBS-holdige medium for at stoppe processen og inaktivere trypsinen.Centrifuge cellerne ved 400 gange G i fem minutter. Og forsigtigt fjerne supernatant uden at forstyrre cellen pellet. Cellerne vaskes med en milliliter PBS.Derefter re-suspendere cellerne i 300 mikroliter af celle fiksering løsning og overføre dem i flow cytometri rør. Brug et flow cytometer til at analysere cellerne ved 488 nanometer. For at forberede cellerne til fluorescensmikroskopi, tilsættes en milliliter kølet methanol til hver brønd for at fikse cellerne.Der tilsættes 500 mikroliter af en 300 nanomolaropløsning af DAPI opløst i PBS til hver brønd. Inkubere i mørke i fem minutter. Derefter fjernes DAPI-opløsningen, og cellerne vaskes igen med 100% methanol, der tidligere blev opbevaret ved minus 20 grader Celsius.Brug et fluorescensmikroskop til at analysere cellerne ved hjælp af de excitation og emissionsbølgelængder, der vises her. I denne undersøgelse genereres nanoliposomer med høj indkapslingseffekt for syntetisk modificeret mRNA. Ved hjælp af RNA kvantificeringssættet kan nanoliposoternes indkapslingseffekt analyseres efter indkapsling af et mikrogram eGFP-kodning mRNA ved at analysere den frie mængde mRNA, som ikke er indkapslet.Efter indkapslingen af EGFP mRNA i forskellige mængder nanoliposomer kan de dannede nanolipoplexer inkuberes med celler in vitro, og procentdelen af eGFP-ekspresserende celler kan analyseres ved hjælp af flowcytometri 24 timer efter transfektion. Som det ses her, selv kun en mikroliter af nanoliposomer opløsning er tilstrækkelig til at opnå en høj transfection af cellerne invitro. Når cellerne transfekteres med nanoliposomer, der indeholder Cy3 mærket eGFP mRNA, kan tilstedeværelsen af eGFP mRNA i cytoplasmaet samt det allerede producerede eGFP-protein visualiseres.Da transinfektion af celler, der anvender nanolipoplexer, kan have negative virkninger på cellerne, blev cellernes levedygtighed testet efter 24 timer og 72 timer efter transfektion. Der kunne ikke påvises virkninger på cellernes levedygtighed, når cellerne blev behandlet med 2,5 eller fem mikroliter nanolipoplexer. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at arbejde i et ethanolfrit miljø hele tiden, fordi dette kan skade nanoliposom stabilitet.Mens du forbereder og blander DC-kolesterol med DOPE, bør du bruge en glaspipette for at undgå forurening af de opløste lipider med opløselige komponenter i plast pipettespidser. Efter denne protokol kan de genererede nanoliposomer let manipuleres under eller efter præparatet. For eksempel vil inkorporering af PEG-molekyler eller specifikke antistoffer føre til øget stabilitet eller indlede aktiv vævsmålretning.De genererede nanoliposomer opfylder de nødvendige sikkerhedsaspekter og letter mRNA-optagelse i målcellerne. Nanoliposomer, der er komplekst med et specifikt terapeutisk nRNA, kan yde et væsentligt bidrag til udviklingen af nye mRNA-baserede behandlingsterapier inden for f.eks.