1. generazione di nanoliposomi cationici (Figura 1)
<ol><li>Sciogliere i lipidi DC-colesterolo (3beta - cloridrato di colesterolo [N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil]) e DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), consegnato sotto forma di polvere, in cloroformio per ottenere una concentrazione finale di 25 mg/mL. Nota: Conservare i lipidi disciolti a-20 ° C.</li>
	<li>Lavorare con 25 mg/mL di soluzione madre di entrambi i lipidi. Mix 40 µ l del disciolto DC-colesterolo e 80 µ...

Il protocollo presentato descrive la generazione di NLps con efficacia elevata incapsulamento per mRNA sinteticamente modificate, così come la transfezione affidabile di cellule in vitro. Il NLps, inoltre, garantiscono il rilascio di mRNA, che a sua volta, si traduce in una proteina funzionale all'interno delle cellule. Inoltre, le transfezioni utilizzando NLps possono essere eseguite a mezzo cellulare regolare, conseguente alta cella viabilità durante transfezione e durare fino a tre giorni dopo la trasfezion...

L'uso di mRNA modificate per applicazioni terapeutiche ha dimostrato grandi potenzialità nell'ultimo paio di anni. Nelle malattie cardiovascolari, infiammatorie e monogenetica, così come lo sviluppo di vaccini, mRNA è un agente terapeutico promettente1.
Terapia sostitutiva della proteina con mRNA offre diversi vantaggi rispetto alla terapia genica classica, che si basa sulla transfezione del DNA nelle cellule bersaglio2. La funzione di mRNA avvia direttamente nel citosol. Anche se il plasmide DNA (pDNA), un costrutto di double-stranded, circolare DNA che contiene una regione di promotore e una sequenza del gene che codifica la proteina terapeutica3, anche atti nel citosol, può solo essere incorporata nelle cellule che stanno attraversando la mitosi al momento della trasfezione. Questo riduce il numero delle cellule transfettate in tessuto1,4. In particolare, la transfezione di tessuti con attività debole mitosi, come cellule cardiache, è difficile5. A differenza di pDNA, la transfezione e la traduzione di mRNA si verificano nelle cellule mitotiche e non-mitotica in tessuto1,6. L'integrazione virale del DNA nel genoma ospite può venire con effetti mutageni o reazioni immunitarie7,8, ma dopo la trasfezione di cellule con una codifica della proteina mRNA, la sintesi de novo della proteina voluta inizia in modo autonomo9,10. Inoltre, la sintesi delle proteine può essere regolata precisamente alla necessità del paziente attraverso dosi individuali, senza interferire con il genoma e rischiare gli effetti mutageni11. Il potenziale d'attivazione immunitaria del mRNA sinteticamente generato potrebbe essere drasticamente abbassato utilizzando pseudo-uridina e 5'-methylcytidine invece di uridina e citidina12. Pseudo-uridina modificate mRNA inoltre è stato indicato per avere una maggiore stabilità biologica e una significativamente più alta capacità traslazionale13.
Per poter beneficiare delle proprietà promettenti di terapia a base di mRNA in applicazioni cliniche, è essenziale per creare un veicolo adatto per il trasporto del mRNA nella cellula. Questo veicolo dovrebbe sopportare non tossico proprietà in vitro e in vivo, proteggere il mRNA contro nucleasi-degradazione e fornire sufficiente assorbimento cellulare per una disponibilità prolungata e la traduzione del mRNA14.
Tra tutti i tipi di vettore possibile per in vivo somministrazione di farmaci, quali nanotubi di carbonio, punti quantici e liposomi, quest'ultimo è stati studiati più di15,16. I liposomi sono vescicole costituito da un doppio strato di lipidi10. Sono anfifiliche con un idrofobo e una sezione idrofila, e attraverso l'auto-organizzazione di queste molecole, un doppio strato sferico è formata17. All'interno di liposomi, agenti terapeutici o farmaci possono essere incapsulati e, così, protetti dalla degradazione enzimatica18. Liposomi contenenti N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cani)21, o DC-colesterolo22, sono ben caratterizzati e frequentemente utilizzati per la transfezione cellulare con DNA o RNA.
Liposomi cationici comprendono un caricato positiva del lipido e un fosfolipide uncharged23. Transfezione tramite liposomi cationici è uno dei metodi più comuni per il trasporto di acidi nucleici in cellule24,25. Le particelle di lipide cationico formano complessi con i gruppi fosfato negativamente caricato nella spina dorsale di molecole di acido nucleico26. Questi cosiddetti lipoplessi attaccare alla superficie della membrana cellulare ed entrano nella cellula tramite endocitosi o meccanismi di endocitosi-come27.
Nel 1989, Malone et al. descritto con successo mediata dei lipidi cationici mRNA transfezione28. Tuttavia, utilizzando una miscela di DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), il gruppo ha trovato che DOTMA manifestato effetti citotossici28. Inoltre, Zohra et al hanno dimostrato che DOTAP (cloruro di 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilammonio-propano) può essere utilizzato come un reagente di transfezione mRNA29. Tuttavia, per l'efficiente transfezione delle celle, DOTAP dovrebbe essere usato in combinazione con altri reagenti, come fibronectina29 o DOPE30. Finora, DOTMA era il primo lipide cationico sul mercato utilizzato per la consegna di gene31. Altri lipidi sono usate come supporto terapeutico o vengono testati in diverse fasi della sperimentazione clinica, (ad es., EndoTAG-I, contenente DOTAP come un elemento portante del lipido), è attualmente oggetto di indagine in un trial clinico di fase-II32.
Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di NLps contenente DC-colesterolo e DOPE. Questo metodo è facile da eseguire e permette la generazione di NLps di diverse dimensioni. L'obiettivo generale di generazione di NLp utilizzando il metodo a secco-pellicola è quello di creare liposomi per complessazione di mRNA, consentendo così efficiente e biocompatibile cellula trasfezione in vitro14,33.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3&#946;-[N-(N&#8242;,N&#8242;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#160;&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACScan system</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Fix (10x)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>340181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>20385.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini extruder</td>
			<td>Avanti, Alabama, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>Q33140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (w/o phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Pseudouridine-5&#39;-Triphosphate (&#936;-UTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Methylcytidine-5&#39;-Triphosphate (Methyl-CTP)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td>
			<td>N-1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3-CTP</td>
			<td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td>
			<td>NEL580001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium, Fremont, USA</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD DNA ladder mix</td>
			<td>VWR, Pennsylvania, USA</td>
			<td>25-2040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific, G&#246;teborg, 
			Sweden</td>
			<td>11528766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cationic nanoliposomes for the efficient delivery of in vitro transcribed messenger rna

Lo sviluppo di RNA messaggero (mRNA)-base terapeutica per il trattamento di varie malattie diventa sempre più importante a causa del positivo proprietà in vitro di trascritti di mRNA (IVT). Con l'aiuto di IVT mRNA, la sintesi de novo di una proteina desiderata può essere indotta senza modificare lo stato fisiologico della cellula bersaglio. Inoltre, biosintesi della proteina può essere controllato proprio a causa dell'effetto transitorio di IVT mRNA.
Per l'efficiente transfezione delle celle, nanoliposomi (NLps) possono rappresentare un veicolo di consegna sicura ed efficiente per mRNA terapeutico. Questo studio descrive un protocollo per generare sicura ed efficiente cationici NLps costituito da DC-colesterolo e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) come un vettore di consegna di IVT mRNA. NLps avendo una definita dimensione, una distribuzione omogenea e una capacità di complessazione alta e può essere prodotto utilizzando il metodo di film secco. Inoltre, presentiamo sistemi di prova differenti per analizzare loro complessazione ed efficacies di transfezione utilizzando sintetico enhanced proteina fluorescente verde (eGFP) mRNA, come pure il loro effetto sulla vitalità cellulare. Nel complesso, il protocollo presentato fornisce un approccio efficace e sicuro per complessazione di mRNA, che può progredire e migliorare l'amministrazione di mRNA terapeutico.

Utilizzando il protocollo come descritto, NLps consistente dei lipidi DC-colesterolo e DOPE sono state preparate utilizzando il metodo di film secco (Figura 1). Durante la preparazione, la soluzione di nanoliposome Mostra diverse fasi di torbidità (Figura 2).
L'efficacia di incapsulamento del NLps può quindi essere analizzato dopo l'incapsulamento di 1 µ g di mRNA co...

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Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Questo protocollo consente la produzione di nanoliposomi sicuri ed efficienti che possono essere utilizzati come veicoli di trasfezione per l'RNA messaggero terapeutico. Questi nanoliposomi facilitano l'assorbimento di mRNA nelle cellule con conseguente aumento dei livelli di espressione proteica senza influire sulla vitalità cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è la generazione rapida e facile di nanoliposomi stabili con dimensioni definite e distribuzione omogenea.Inoltre, proteggono l'mRNA incapsulato dalla degradazione e portano a una traduzione prolungata. A dimostrare la procedura sarà Antonia Link, dottoranda del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare soluzioni stock per lipidi, colesterolo DC e DOPE sciogliendo ciascuno in cloroformio ad una concentrazione finale di 25 milligrammi per millilitro.Mescolare 40 microlitri del colesterolo DC disciolto con 80 microlitri della DROGA disciolta in un pallone di vetro. Vaporizzare il cloroformio sotto un flusso di gas argon per 15 minuti. Quindi, riempire un essiccatore con gel di silice.Posizionare il pallone di vetro aperto all'interno e applicare un vuoto durante la notte per assicurarsi che il cloroformio rimanente sia evaporato. Il film lipidico risultante si formerà all'interno del pallone di vetro. Il giorno dopo, aggiungere un millilitro di acqua priva di nucleasi per reidratare il film lipidico.E vortice la sospensione per 15 minuti. Posizionare la sospensione in un bagno di sonicazione per un'ora. Successivamente, assemblare il mini estrusore secondo le istruzioni dei produttori.Riempire una siringa con la sospensione liquida e posizionarla su un lato dell'estrusore. Posizionare una siringa vuota sull'altro lato. Premere la sospensione lipidica attraverso la membrana da una siringa all'altra, circa 20-25 volte per estrudere la sospensione.Quindi, conservare i nanoliposomi in un pallone di vetro a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. In primo luogo, scongelare l'mRNA sintetico sul ghiaccio. Vortice l'mRNA congelato e poi centrifugarlo poco prima di aprire il tubo.Quindi, mescolare un microgrammo dell'mRNA sintetico con varie quantità di sospensione nanoliposoma. Centrifugare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per la formazione di nanolipoplex. Quindi, aggiungere millilitro di mezzo cellulare regolare al nanolipoplex e mescolare pipettando su e giù.Preparare le cellule un giorno prima della trasfezione. Pertanto, placcare 150.000 celle A549 in ogni pozzo di una piastra di 12 po 'un giorno prima della trasfezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e mezzo cellulare regolare per 24 ore.Quindi il giorno dopo, lavare ogni pozzo di cellule preparate una volta con un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di una miscela di nanolipoplex preparata a uno dei pozzi contenenti le cellule A549. Incubare a condizioni regolari per 24 ore per analizzare l'efficienza di trasfezione o per 24-72 ore per analizzare la vitalità cellulare dopo la trasfezione.Rimuovere il supernatante e lavare ogni bene con un millilitro di PBS per rimuovere i restanti nanoliposomi. Per preparare le cellule per la citometria, aggiungere prima 500 microlitri di EDTA di tripina ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti per tripinare le cellule. Quindi, aggiungere 500 microlitri di mezzo normale contenente FBS per interrompere il processo e inattivare la tripina.Centrifugare le cellule a 400 volte G per cinque minuti. E rimuovere con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule con un millilitro di PBS.Quindi sospendere di nuovo le celle in 300 microlitri di soluzione di fissaggio cellulare e trasferirle in tubi di citometria a flusso. Usa un citometro a flusso per analizzare le cellule a 488 nanometri. Per preparare le cellule per la microscopia a fluorescenza, aggiungere un millilitro di metanolo refrigerato ad ogni pozzo per fissare le cellule.Aggiungere 500 microlitri di una soluzione di 300 nanomolare di DAPI disciolta in PBS ad ogni pozzo. Incubare al buio per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione DAPI e lavare nuovamente le celle con metanolo al 100% precedentemente conservato a meno 20 gradi Celsius.Utilizzare un microscopio a fluorescenza per analizzare le cellule utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione mostrate qui. In questo studio, i nanoliposomi sono generati con un'elevata efficacia di incapsulamento per mRNA modificato sinteticamente. Utilizzando il kit di quantificazione dell'RNA, l'efficacia di incapsulamento dei nanoliposomi può essere analizzata dopo l'incapsulamento di un microgrammo di mRNA codificante eGFP analizzando la quantità libera di mRNA che non è incapsulata.Dopo l'incapsulamento dell'mRNA EGFP in diverse quantità di nanoliposomi, i nanolipoplex formati possono essere incubati con cellule in vitro e la percentuale di cellule che esprimono eGFP può essere analizzata usando citometria a flusso 24 ore dopo la trasfezione. Come si vede qui, anche solo un microlitro della soluzione di nanoliposomi è sufficiente per ottenere un'elevata trasfezione delle cellule invitro. Quando le cellule vengono trasfette con nanoliposomi contenenti mRNA eGFP etichettato Cy3, è possibile visualizzare la presenza dell'mRNA eGFP nel citoplasma, così come la proteina eGFP già prodotta.Poiché la trasfezione di cellule che utilizzano nanolipoplex può avere effetti avversi sulle cellule, la vitalità delle cellule è stata testata dopo 24 ore e 72 ore dopo la trasfezione. Non è stato possibile rilevare alcun effetto sulla vitalità cellulare quando le cellule sono state trattate con 2,5 o cinque microlitri di nanolipoplex. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di lavorare continuamente in un ambiente privo di etanolo perché ciò potrebbe danneggiare la stabilità dei nanoliposomi.Durante la preparazione e la miscelazione del colesterolo DC con DOPE, è necessario utilizzare una pipetta di vetro per evitare la contaminazione dei lipidi disciolti con componenti solubili di punte di pipetta di plastica. Seguendo questo protocollo, i nanoliposomi generati possono essere facilmente manipolati durante o dopo la preparazione. Ad esempio, l'incorporazione di molecole PEG o anticorpi specifici porterebbe a una maggiore stabilità o avvierebbe il targeting attivo dei tessuti.I nanoliposomi generati soddisfano gli aspetti di sicurezza necessari e facilitano l'assorbimento dell'mRNA nelle cellule bersaglio. I nanoliposomi complessi con uno specifico nRNA terapeutico possono dare un contributo essenziale allo sviluppo di nuove terapie a base di mRNA nel campo dell'ingegneria tissutale o della terapia sostitutiva, ad esempio.