Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers

Vi beskriva ett arbetsflöde för analys av genuttryck från endotelceller omfattas av en stadig laminärt flöde använder flera övervakade parallell-plattan flöde chambers. Endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärl och kroniskt är utsatta för friktion kraft blodflödet kallas skjuvspänning. Under fysiologiska betingelser, endotelceller funktion i närvaro av olika skjuvspänning. Tillämpningen av skjuvspänning i in vitro- modeller kan således ge större insikt i endotel Svaren i vivo. Parallell-plattan flöde kammaren tidigare utgiven av Lane et al. ⁹ är anpassad att studera endothelial genreglering i närvaro och frånvaro av stadig (icke-pulserande) laminärt flöde. Viktiga anpassningar i upplägget för laminär som presenteras här inkluderar en stor, dedikerad miljö att huset samtidiga flöde kretsar, övervakning av flöden i realtid, och införandet av en exogen referens RNA för normalisering av kvantitativ realtids PCR-data. För att bedöma flera behandlingar/villkor med tillämpning av skjuvspänning, används flera flöde kretsar och pumpar samtidigt inom samma uppvärmd och befuktade inkubatorn. Flödet av varje flöde krets mäts kontinuerligt i realtid för att standardisera skjuvspänning i hela experimenten. Eftersom dessa experiment har flera villkor, använder vi också en exogen referens-RNA som är spetsade-i vid tidpunkten för RNA-extraktion för normalisering av RNA-extraktion och första-strand cDNA syntes effektivitetsvinster. Dessa steg minimera variabiliteten mellan prover. Denna strategi är anställd i vår pipeline för gen uttryck analys med skjuvspänningen experiment med parallell-plattan flöde kammaren, men delar av denna strategi, såsom den exogena referera RNA spike-i, kan enkelt och kostnadseffektivt sätt användas för andra program.