Expressão independente de metanol por Pichia Pastoris , empregando tecnologias de repressão

O metanol é uma fonte de carbono bem estabelecida e indutor para a produção de proteína eficiente empregando Pichia pastoris (p. pastoris) como um host em escala micro, laboratório e industrial. No entanto, devido à sua toxicidade e inflamabilidade, há um desejo de evitar o metanol, mantendo a alta produtividade de p. pastoris. Cultivos de biorreator de pequena escala (0,5-5 volume de trabalho L) são comumente usados para avaliar uma estirpe e suas características de produção de proteína, pois microescala cultivo em placas de poço profundo pode ser mal controlado ou se baseia em um equipamento caro. Além disso, protocolos tradicionais para o cultivo e a indução de p. pastoris foram estabelecidos para indução de expressão ou metanol constitutiva e, até agora, que nenhum confiáveis protocolos foram descritos para a expressão de p. pastoris de tela cepas de derepressible promotores em cultivos paralelos (controlados e monitorados). Para simplificar esses cultivos iniciais para caracterizar e comparar novas cepas de produção de proteína, nós estabelecemos um sistema de cultivo de balão simples agitar para metanol livre expressão que simula condições de biorreator incluindo um glicerol lenta constante alimentar e monitoramento on-line, assim, aproximar-se às condições reais de biorreatores em comparação com cultivos de lote na maior parte aplicada em pequena escala. Para dirigir a expressão de proteínas recombinantes em p. pastoris, a fonte de carbono reprimida promotores P_DC e P_DF foram aplicados. Polímero discos com fonte de carbono incorporado, liberando uma quantidade constante de glicerol, garantida uma taxa de alimentação, fornecendo a energia necessária para manter os promotores ativo, mantendo a geração de biomassa baixa.