ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

Summary

モルモット PBMCs のインターフェロン-γ しなさい測定法の開発では、感染症を研究するためこの関連性の高いモデルで T 細胞の反応特性をことができます。我々 は、関連付けられている DNA ワクチンの皮内送達 T 細胞の反応を測定するアッセイを適用しています。

Abstract

モルモットは、結核、インフルエンザ、ジフテリア、およびウイルスの出血熱などの感染症のためのワクチンの開発に関連する小さな動物モデルとして極めて重要な役割を果たしました。皮膚にプラスミド DNA (pDNA) ワクチンの配信がモルモットの堅牢な体液性応答を誘発しました。ただし、このモデル免疫動物の使用幾分使用可能な試薬および T 細胞の反応を研究するためのプロトコルの不足のため過去に限られていた。T 細胞は、immunoprophylactic と免疫療法のメカニズムの両方で極めて重要な役割を果たします。T 細胞の反応を理解することは、感染症・腫瘍ワクチン収容配信デバイスの開発にとって重要です。ここギニア豚末梢血単核球 (PBMCs) ためインターフェロン γ (IFN-γ) の酵素 immunospot (しなさい) 試金を記述します。アッセイこの重要な齧歯動物モデルでワクチン特定の T 細胞の応答を評価することも可能。 にします。末梢血から分離した細胞を分析する能力は、個々 の動物で免疫原性を追跡する機会を提供します。

Introduction

ここで説明したプロトコル インターフェロン-γ の検出が可能でモルモットから採取した末梢血単核球 (PBMC) 人口の抗原リコール後 (IFN γ) 分泌細胞。我々 はモルモットでインフルエンザの予防接種療法に対する抗原特異的 T 細胞応答の大きさと速度を特徴付けるアッセイを適用しています。このプロトコルは、この関連性の高い動物モデルでのワクチン接種プログラムの前臨床開発を推進する大幅と考えています。

ワクチンによって誘発される T 細胞は、感染性病原体やその他の病気と関連付けられる免疫療法経路に対する保護に重要な役割を果たします。T 細胞の重要性は、複数のワクチンの研究で強調表示されています。フェレットと H5 ヘマグルチニンと N1 ノイラミニダーゼを提供保護の罹患率と死亡率の重要性を示す抗体を中和することの不在でインフルエンザ ウイルス チャレンジからのエンコーディングとプラスミド DNA (pDNA) マウスの免疫T 細胞免疫¹。このほかに強い体液性応答を中和 T 細胞再生ウイルスクリアランス²だけでなく、呼吸器合胞体ウイルス (RSV) と感染症からの保護に重要な役割でマウス³。人間、2009 年⁴パンデミック H1N1 は、中には既存の cd 8 + T 細胞が減少疾患重症度と関連付けられました。一緒に特定のサイトカインの血中の cd4 陽性 T 細胞数は、RSV に感染した小児⁵疾患重症度に関連付けられます。

モルモット皮膚感作性、栄養研究、聴覚系のと、この作品では、感染症に最も関連する研究など医学の様々 な分野で開発の実験的モデルとしての卓越性を得ています。結核、ジフテリア ワクチンの発見のために重要だった。最近では、モルモットはインフルエンザ⁶エボラ⁷モデルとして使用されます。さらに、人間の皮膚⁸生理学的類似点をもつ、モルモットは経皮薬物送達方法のアクセス可能な小さな動物モデルを提供しています。実験的モデルとしてその重要性と対照をなしてモルモット特定試金および免疫反応を特徴付けるためのプローブの可用性限定⁹のままです。など、IFN-γ 酵素 immunospot (しなさい試金) 日常的に T 細胞の応答を列挙する前臨床試験と臨床研究で使用されている基本的な細胞アッセイは利用されていません。

最初の固相酵素 immunospot のアッセイは、多様な B 細胞人口^10,11特定抗体産生細胞の数を決定する使用されました。形式は IL-1, IL-2, を含むサイトカインを分泌細胞を検出する高度な IL 4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF、TNF-α、TNF β、グランザイム B、IFN-γ。なさいアッセイを所有している高感度。可能性のある各サイトカイン産生細胞を検出できます。なさい試金のための検出限界は、100,000 の PBMCs¹²あたり 10 点より低いと報告されています。利用可能な¹³モルモットの IFN-γ 抗体ペアは最近行われた、これはフィールドのこの欠乏に対処するための機会を開いた。

適応免疫応答に重要なエフェクター分子である IFN-γそれは、生産し、活性化 CD4 および CD8 T 細胞によって分泌されることがことができます。IFN-γ が広い生物の範囲が私と MHCII 式 (MHC) マクロファージの活性化と主要な組織適合性の複雑なの規制などのウイルス感染に対する免疫応答のコンテキストで機能します。また、B 細胞の分化を促進する、T ヘルパー 2 細胞の成長を阻害する、ナチュラル キラー細胞を活性化します。インターフェロン-γ は、感染細胞の MHC 分子の upregulates 発現ウイルス複製をブロックします。したがって、IFN-γ の生産は、ワクチンや病原体に対する T 細胞応答の質の非常に重要な徴候です。

ここで提示された IFN-γ しなさいの重要な側面は、脾細胞よりもむしろ PBMCs の¹³の使用です。PBMCs は脾細胞のコレクションは、脾臓の収穫前に動物 euthanization を必要とするのに対し非終端収集した血液サンプルを処理することによって得られます。PBMCs 時間帯とプライム ブースト レジメン¹⁴など T 細胞応答に及ぼす影響の評価を監視する IFN-γ T 細胞応答を使用します。

現在、モデル動物としてモルモットを使用している研究者、IFN-γ しなさい方法は積むことができる科学的なデータの範囲を広げます。その可用性は今細胞応答の検査のための試薬の可用性のため以前に選ばれた対象疾患の関連性の低い動物モデルでの研究を実施する必要性を減らすことができます。脾臓やリンパ節ではなく、PBMCs の使用できます非ターミナル実験と個々 の動物の継続的な監視します。

以下 pDNA ワクチンに対するモルモットにおける IFN γ 細胞反応の検出に必要な手順の詳細な説明を提供します。私たちの特定の配信手順の概要を説明し、採血、血液処理、PBMC の収穫、試金プロシージャおよびデータ解析を含む一般的なしなさい試金を記述します。なさい測定の模式図は、図 1に描かれています。

図 1: モルモットしなさいプロトコルの概要。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会 (ACUC) の Acculab によって承認されています。

注: プロトコルは、潜在的な有害物質の使用を必要とします。メーカーの MSDS を参照してください、手順適切な個人用具 (PPE) を着用してください。

1. 皮のツベルクリン注射、CELLECTRA 3 P EP プロシージャ モルモット予防接種サイトの準備

1. モルモットに治療部位の準備。
   1. 誘導室でモルモットを置き、5% で anaesthetize イソフルラン蒸気。
   2. 商工会議所から動物を削除し、プロシージャ全体で麻酔を維持するために 2% イソフルラン蒸気を提供する位置に鼻の円錐形を配置します。
   3. 腹部の側面に約 4 cm²の領域を剃る。
   4. 消毒エタノール綿棒と剃毛エリア。
2. PDNA 定式化とエレクトロポレーションのプロシージャの注入。
   1. ツベルクリンによる真皮に 100 μ l の製剤を注入するのにインスリン注射を使用します。針の挿入を動物の体内に 10 度の角度で傾斜します。
   2. 針を除去しすぐに注入膨疹の間で CELLECTRA®-3 P の電極を挿入し、電気フィールドを適用します。
   3. 麻酔から動物を削除し、その回復を監視します。

2. 非終端を出血します。

1. 麻酔モルモットの頸静脈から採血。
   1. 誘導室でモルモットを置き、1.1.1 で説明されているように、動物を anaesthetize
   2. 27 1/2 インチ針付き 3 ml シリンジを使用して、麻酔動物の内頚静脈を強調し、3 ミリリットルの血液を収集します。
   3. K2EDTA 採血管に血液をすぐに転送、ミックス血液抗凝固剤と氷の上の場所に複数回チューブを反転します。
      注: 血液凝固の防止、血液サンプルのダウン ストリーム処理に成功したことが欠かせません。
   4. 動物の回復を監視します。

3. 血液サンプル処理

1. 密度勾配の遠心分離によって血中から PBMCs の分離
   1. 1:1 でハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 血液を希釈します。
      注: 安全キャビネットの無菌技術を適用することでここから働くすべての汚染を避けるためを実行する必要があります。
   2. 層は、血液徐々 に 4.5 ml Ficoll Paque プラス 15 ml コニカル チューブを希釈しました。インターフェイスの障害を避けてください。注: 適切な分離を確保するため Ficoll Paque は室温である必要があります。
   3. ブレーキ付け 30 分 800 メーカでチューブを遠心分離機、オフ。
      注: 代わりに、SepMate™ チューブ (幹細胞技術) は PBMC 分離に使用できます。HBSS 希釈血液が 15 ml SepMate チューブ 3.5 ml に追加されます Ficoll Paque プラス 10 分 (ブレーキ) 1200 rcf の遠心しと。この時間節約勾配遠心法は、等しい生存率、細胞収量およびスポット形成の結果します。
   4. バフィー コート層を収穫し、R10 培地で希釈 (10% (v/v) 熱-無効に FBS と 1% (v/v) ペン/連鎖球菌 RPMI1640 培地で) 15 ml の容量に。
   5. 5 分の 450 rcf の遠心分離によって細胞をペレットします。
   6. R10 の中で 2 回細胞を洗浄します。
   7. 再 1 ml R10 を中断し、で 70 μ m セル ストレーナーを介して細胞懸濁液を新しいチューブに渡します。
   8. セルをカウントし、トリパン ブルー染色により生きているセルの数を決定します。
   9. 1 x 10 の濃度に R10 培地で細胞を希釈 ^ ml あたり 6 生きているセル。

4 作成しなさいプレートと細胞刺激

1. コートとブロックの井戸、PBMCs を播種する前に 96 ウェルしなさい PVDF 膜プレート。
   1. プレートは、60 秒の前処理する必要があります。エタノール前処理は、あまり不特定のスポット形成と改良された定義のスポットになります。
      : 注意完全な膜が 15 μ l の 35% と接触するように余分な注意エタノール。
   2. 60 秒後、好評につき、150 μ l 1 × PBS を追加し、プレートを反転で井戸を空します。
      注: エタノール前処理は非常に時間に敏感です。以上 60 秒膜する必要があります手順の次の手順の間に乾燥しても膜を孵化しないで。
   3. ウェルあたり 3 回 250 μ l 1 × PBS でプレートを洗います。
   4. PBS の IFN-γ 抗体 V E4 5 μ g/ml のキャプチャ抗モルモットの 100 μ l/ウェルでコートします。
   5. 少なくとも 12 の版を孵化させなさい 4 ° C での時間
   6. 3 倍の 250 μ l/ウェル PBS を追加することでプレートを洗います。
   7. 200 μ l/ウェル ブロック バッファー (10% (w/v) ショ糖と 2% (w/v) BSA PBS で) を追加し、室温で 2 時間インキュベートします。
   8. 250 μ l/ウェル PBS でプレートを 3 回洗浄します。
2. 抗原特異的ペプチド、正と負のコントロール プレート PBMCs。
   1. R10 でタンパク質-ペプチド プール目的最終的なペプチド濃度を薄くしなさい。
   2. トリプリケートでサンプル PBMCs の試金します。
      注: 最初にしなさい板中、覚醒剤を追加、PBMC サスペンションを 2 番目に追加。
   3. 示されている井戸にペプチド R10 媒体の 50 μ l を追加します。
   4. 陰性対照の示された井戸に R10 で 50 μ l 空ペプチド製剤を追加します。
   5. 肯定的な制御 R10 中示されている井戸に 5 μ g/ml コンカナバリン A (ConA) を追加します。
   6. すべての井戸に PBMC 細胞懸濁液 100 μ l を追加します。
   7. 18 37 ° 摂氏加湿 5 %co2 雰囲気の中で板をインキュベート時間。
      注: 場所しなさいインキュベーターでも表面/ラックのプレートし、プレートの培養時間の間に任意の妨害を避けるため。

5. インターフェロン-γ 肯定的なスポットの検出

1. 検出抗体とプレートの開発と孵化します。
   注: このセクションのすべての手順の無菌技術は必要ありません。
   1. インキュベーターからプレートを慎重に取り外し、安全に空の井戸。3 倍の 250 μ l/ウェル PBS を追加することでプレートを洗います。
   2. ブロック バッファーに 2 μ g/ml ビオチン検出抗モルモット IFN-γ 抗体の N G3 希釈 100 μ l/ウェルを追加します。
      注: フィルターは (22 μ m) 背景を抑える抗体溶解液。
   3. 2 の検出の抗体とインキュベート時間室温で。
   4. 上澄みと洗濯板を破棄するには、追加の 250 μ l/ウェル PBS 3 回。
   5. アルカリホスファターゼ (ALP) の 100 μ l/ウェルを追加-共役ストレプトアビジン ブロック バッファーで希釈しました。
      注: バック グラウンドを抑えるフィルター (22 μ m) ソリューション。
   6. ALP ストレプトアビジン共役、室温で 1 時間インキュベートします。
   7. ALP ストレプトアビジン ソリューションを破棄し 250 μ l/ウェル PBS を 2 回追加することによってプレートを洗浄し、プレートを反転ときれいなペーパー タオルに対してそれをしみが付くことによって余分な PBS を除去します。
   8. 1 回 250 μ l/ウェル超純水・ ディ ・水を追加することでプレートを洗浄し、プレートを反転ときれいなペーパー タオルに対してそれをしみが付くことによって余分な水分を削除します。
   9. 各ウェルに 100 μ l の BCIP/NBT (注意) 基板ソリューションを追加します。注意: BCIP/NBT は非常に可燃性で、皮膚との接触、飲み込んだ場合は吸入毒性です。使用前に MSDS を参照してください。
   10. 光から保護された室温で 20 分間インキュベートします。
   11. 脱イオン水で 4 回プレートをすすいでください。プレートを反転し、余分な水分を削除するをタップします。
   12. プラスチック排水をしなさい板の下部から外し、乾燥するプレートを許可します。
   13. 手動または自動化しなさいリーダー、CTL Immunospot S6 プレート リーダーなどを使用してスポットを定量化します。

Discussion

モルモットは、ワクチンや皮内配信戦略の前臨床開発の貴重な動物モデルです。上記のプロトコルでは、このモデルで関連性の高い抗原特異的 T 細胞の反応を測定するための方法について説明します。アッセイは、末梢 T 細胞生産インターフェロン-γ 刺激による抗原特異的ペプチドとの明確な列挙体を提供します。非端末採血による免疫応答の動態を監視できます。

プロトコルを最適化し、この試金を使用して最適な結果を得るための重要な側面を識別します。たとえば、コレクションの管の血栓の形成は、次善の PBMC の回復と生存率になります。モルモット血液が凝固¹⁸を非常に急速に。絵を描く血を迅速に実行することが重要です。Au Birckらはモルモット モデル¹⁶の技術を出血の包括的なガイドを提供します。血のコレクションは、全身麻酔を必要とするので、手順¹⁹のこの側面の該当する標準操作手順を確認することをお勧めします。麻酔が不十分なモルモットは、あなたの爪や耳を尻込みしてひげが彼らの耳をつまんで後転送移動指の間、足や組織の簡単なピンチ後の発声を移動することによって反応します。圧延または数回チューブの反転によって徹底的に抗凝固薬とミックス チューブに血液の即時転送は、このプロトコルの重要なステップです。ここで説明されているプロトコルの EDTA 管が使用され、他の抗凝固薬はテストされていません。EDTA は高張、チューブ必要があります理想的にはいっぱいに半分以上、したがって適切なチューブ サイズ サンプル ボリュームを使用する必要がありますに注意してください。

正しく実行されると、密度勾配遠心法は一貫してクリーン PBMC 準備の結果します。遠心分離の前にグラデーションを重ねるとき、密度勾配媒体が室温である必要があります、通常の管を使用する場合、遠心分離機を停止して、ブレーキを使用しないでください。PBMC 処理の実用性の面で大幅な改善は、密度勾配遠心 PBMC 免震装置の組み合わせだった。遠心分離の時間を短縮をできます。密度勾配遠心法 PBMC 免震装置で、通常の管と同様の生存率の結果加工 PBMCs とスポット形成の生きているセルをカウントします。分離用チューブの種類にかかわらず、バフィー コート収穫はすぐに従う必要があります。拡張期間にわたって密度勾配媒体との接触は、PBMCs を細胞傷害性です。

実行可能な PBMCs の正確なカウント種子アッセイ プレートのウェルに細胞数が一貫して同じことが重要です。ライブ/デッド差別のいくつかのメソッドを適用する必要があります。当研究室では、トリパン ブルー排除アッセイ、自動化された細胞カウンターを使用します。

特に自動カウント システムを使用する場合鋭利と対照的なスポットとして定義されているスポットの品質は改善された正確さと一貫性のあるスポット カウントになります。製造元の推奨事項に沿った背景スポットの数を減らすし、スポットの定義を改善する重要なステップをしなさい板のエタノール前処理を見ました。プロトコルの終わりにしなさいアッセイ プレートのイメージをプレート リーダーを使用することを強くお勧めします。各ウェルの元の画像を簡単かつ効率的に入手し、保存します。デジタル画像はまた客観的な分析と個々 のオペレーターによって手動カウントと比較してください。 スポット カウント、画像解析ソフトを使用してください。

ここで説明した試金の開発のための絶対的な必要性の適切な抗モルモット インターフェロン-γ 抗体ペアの世代でした。V E4 と N G3 マウス モノクローナル抗体は、モルモットの組換えインターフェロン ガンマ²⁰で免疫したマウスから B 細胞クローンとハイブリドーマ技術によって開発されました。V-E4、IgG1 アイソタイプであると N-G3、igg2a 産、遺伝子組換えとネイティブ抗原の両方にバインドする報告されます。サンドイッチ elisa 法形式で低バック グラウンド信号を維持しながら検出の抗体遺伝子組換えとネイティブ蛋白質の高感度としてキャプチャ抗体、ビオチン化 N G3 V E4 を割り当てます。本書の共著者である博士ヒューバート ・ シェーファーの研究所を率いる製造契約を通じて科学的なコミュニティに両方の抗体があります。要求はシェーファー博士の研究室で受信して、商業パートナー製。

インターフェロン γ は、通常のバッファーまたはメディア²¹で安定する報告されます。シェーファーら²⁰だけ回収率の適度な減少を報告は、使用劣化 IFN-y、抗体 V E4 と N G3 を使用して ELISA 形式での生物学的機能を失っていたとき。ただし、ペプチド刺激 PBMCs の 18 h 以上のインキュベーション時間を増やす必要があります慎重にテストします。

PBMCs を使用する利点を議論されています。ただし、ここで説明されているアッセイのみ循環周囲に T 細胞の抗原特異的応答を反映します。組織浸潤 T 細胞または脾臓やリンパ節などのリンパ系器官から分離した細胞は、異なるプロパティ^22,23,24を表わすかもしれない。PBMCs からインターフェロン-γ スポットと同じ pNP インフルエンザ ワクチン¹⁴免疫モルモットからの脾細胞の比較細胞応答に有意差は認められなかった。

このプロトコルでは、皮内ワクチン接種手順について説明しました。ID 予防接種の主たる根拠は、樹状細胞皮膚²⁵本の高密度を狙っています。私たちと他の人は、これらの細胞は配信方法²⁶、定式化²⁷、または薬物設計²⁸を適応させることによって特に対象と示されています。活性化のプロフェッショナルな抗原提示細胞が排出リンパ節に移行し、適応免疫系^29,30,31,32をアクティブにします。樹状細胞は、生産的な細胞性免疫応答をプライミングのため不可欠な抗原プレゼンテーションの携帯タイプです。

プラスミド DNA エンコード インフルエンザ H1N1 の蛋白で免疫動物本研究 A/PuertoRico/8 のひずみ。皮膚エレクトロポレーション法との組み合わせで (pNP) この pDNA ワクチンの配信は、ヒト以外の霊長類 (NHPs)^1,34フェレット、モルモット³³抗原特異的体液性応答を引き出すために示されていた。また、このワクチンは、CD4 および CD8 T 細胞にこれらの細胞集団の特定のエピトープを表すペプチドで刺激することによって起因する可能性表皮³⁵に、搬入後マウスで堅牢な T 細胞応答を引き出した。PNP のワクチンはマウス³⁶細胞・体液性応答と同様に、ウサギやモルモット、体液性応答の生成によって示されるように粘膜出産後免疫原性もあった。最も最近、当社グループ内の筋肉配信 (未発表データ) ウサギの IFN-γT-細胞応答の生成を示すことでした。

現在、モルモットしなさい観察されるインターフェロン-γ スポットは cd4 や cd8 T 細胞サブセットに割り当てられません。デザイン、皮膚免疫療法の開発の特にインターフェロン γ 観測スポット周波数が 1 つの特定のサブセットの拡張またはするために両方のバランスの取れた応答によって引き起こされるかどうかを決定する非常に役に立つことクロス プレゼンテーションをトリガーするワクチン接種の有効性を評価します。この制限は、負によって克服される可能性があります (cd8 陽性反応) のため私はエピトープを制限 (cd4 陽性反応) の MHC クラス II MHC のクラスの識別、皿の上の細胞を播種する前に CD4 や CD8 細胞の並べ替え。

モルモット PBMCs を使用してここで説明しなさいインターフェロン-γ アッセイ モルモット実験室モデルの細胞反応のコースを評価するニーズに応えます。これはワクチンの開発を調整し、配信プロトコルを皮膚します。TB³⁷、エボラ出血熱³⁸HSV³⁹など重要な T 細胞コンポーネントとの病気を研究するこの動物モデルの雇用のことと考えています。それは関連性の低い動物モデルの使用を削減します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellectra-3P	Inovio Pharmaceuticals		ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only
K2EDTA blood collection tube	BD	367844
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
Ficoll-Paque Plus	GE Healthacre	17144003	density gradient medium
SepMate tube	STEMCELL Technologies	85415	PBMC-isolation device
RPMI	Thermo Fisher	11875-135
heat-deactivated FBS	VWR	97068-085
Pen/Strep	Gibco	15140-122
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
96-well ELISpot PVDF-membrane	Millipore	MSIPS4W10	ELISpot assay plate
Ethanol	Sigma	459844-1L
UPDI	Invitrogen	10977-015	Ultra-Pure DI water
Sucrose	Sigma	S7903
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
10x PBS	HyClone	SH30378.03
Concanavalin A (ConA)	Sigma	C5275-5MG
alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin	R&D Systems Inc.	SEL002
BCIP/NBT	R&D Systems Inc.	SEL002
capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4	GenScript	Order #:U5472CE080-3	LOT # A217071153
biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3	GenScript	Order #:U5472CE080-1	LOT # A21700598
CTL S6 Micro Analyzer	ImmunoSpot	#S6MIC12	automated ELISpot plate reader
Vi-CELL XR	Beckman-Coulter	731050	automated cell counter
ImmunoSpot 5.1	ImmunoSpot		assay analysis software
ESCO Class II Type A2	ESCO		Biosafety cabinet
Falcon cell strainer	Corning, Inc.	VWR cat# 21008-952
Exel Comfort Point Insulin syringe	MedLab Supply	26028
Rotanta 460R	Hettich		centrifuge
Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit	Beckman Coulter	383722
Incu Safe	Panasonic-Healthcare		incubator
22µm Filter	ThermoScientific	VWR act# 597-4520	22µm Filter
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	VWR cat# 21903-005	paper towels