Dette arbeidet ble støttet av en National Science Foundation CAREER-pris (NSF-CMMI-14-54257) og tilskudd fra American Heart Association (16GRNT30930019) og National Institutes of Health (R01GM121739-01) tildelt Dr. Brenton Hoffman og en nasjonal Science Foundation Graduate forskningsstipend tildelt Katheryn Rothenberg. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av NSF eller NIH.

1. Generer prøver for Imaging
<ol><li>Stabilt uttrykke spenningen sensor konstruere i ønsket celle type.<ol>
<li>Klone spenning sensor konstruere inn pRRL vektor- eller andre viral uttrykk plasmider. Merk: Flere ulike molekylær kloning verktøy er tilgjengelig for å oppnå dette trinnet inkludert bruk av begrensning enzymer, overlapper utvidelsen, og Gibson montering35. PRRL-vektor brukes i lenti viral signaltransduksjon og gjør en betydelig grad av protein produksjon gjennom bruk av men...

BÅND-FRAP metoden tillater direkte måling av kraft-sensitive protein dynamikk, en egenskap som har vært vanskelig å direkte undersøke i levende celler. Følsomheten til protein dynamics molekylær lastes er kritisk til protein's fungerer som en kraft senderen eller transduktor. Lasting kreves for overføring av både internt generert og eksternt brukte styrker, kalt mechanotransmission, og for konvertering av disse styrkene til biokjemisk-detectable signaler, kalt mechanotransduction. Imidlertid endringer i belastni...

Ekstracellulære miljøet er en rik kilde til både biokjemiske og fysiske signaler som styrer celle atferd. Spesielt kan fysisk natur av microenvironment formidle viktige cellulære funksjoner, inkludert cellevekst, migrasjon og differensiering1,2,3,4. Feilregulering om mekanikken i microenvironment er en kritisk komponent for mange sykdommer som ennå ikke har tilstrekkelig behandlinger, for eksempel kreft5, aterosklerose6og fibrose7. En fullstendig forståelse av hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokjemisk-detectable signaler, en prosess kalt mechanotransduction, krever utviklingen av molekylære mekanismer formidling styrke overføring, både inn og ut av cellene og innen flere subcellular strukturer.
I subcellular strukturer blir proteiner stadig over; bindende og frigiving basert på styrken av deres interaksjon med bindende partnere8. For styrker å være overføres over en fysisk avstand, må det være en ubrutt klareringskjede protein-protein interaksjoner, betyr at et protein omsetning må være treg nok til å opprettholde og overføre makt til sin bindende partner9. Mens protein-protein interaksjoner består vanligvis av flere ikke-kovalente bindinger mellom protein domenene, er samspillet ofte definert som en bundet tilstand som kan gå til en ubundet tilstand under ulike forhold10, 11. en gitt protein-protein interaksjon, er det mulig at makt kan har ingen effekt på levetiden til samhandling, kjent som en "ideell bånd", redusere levetiden til samhandling, kjent som en "slip bånd", eller øke levetiden til samhandlingen , kjent som en "catch bånd"10. Således, det er en intrikat sammenheng mellom protein belastning og protein dynamikk, som vi kaller kraft-sensitive dynamikk.
Mot å forstå effekten av belastningen på bond dynamics, har en rekke svært informativ eksperimenter utført på enkelt-molekylet nivå. Bruker isolert proteiner eller fragmenter av proteiner og manipulasjon teknikker som magnetiske pinsett, optisk pinsett og atomic force mikroskopi, har disse studiene vist kraft-sensitive protein-protein interaksjoner i flere relevante proteiner11,12. Begge integrins13 og cadherins14, som transmembrane proteiner viktig for å danne celle-matrise og celle-celle interaksjoner, henholdsvis, har vist endringer i dynamics grunn for å laste. Inne i cellen, vinculin er rekruttert til begge talin15 og α-catenin16 i en makt-avhengige måte og kan danne en fange bånd med utgangen17, som indikerer en avgjørende rolle for vinculin både fokal adhesjon (FAs) og adherens veikryss (AJs ) under belastning. Single-molekylet studier tillater isolering av bestemt protein-protein interaksjoner og entydig resultater, men de ikke gjøre rede for kompleksiteten i mobilnettet miljø.
Landemerke eksperimenter har vist at flere subcellular strukturer, inkludert FAs og AJs, er mechanosensitive, og viser forbedret montering svar på internt generert eller eksternt brukte laster18,19, 20,21,22. I tillegg har flere teoretiske modeller antydet at mechanosensitive montering kan være drevet av kraft-sensitive protein dynamics23,24,25. For å undersøke disse kraft-sensitive dynamikk i levende celler, er noen indirekte tilnærminger tatt. FRAP og relaterte teknikker gi en relativt enkel metodikk for måling av protein dynamikk i celler26,27,28,29. Måling av protein belastning har imidlertid vært mer begrenset. En typisk bruksmåte er å sammenligne protein dynamikk i celler med og uten eksponering en cellen cytoskjelett hemmer brukes til å redusere totale celle contractility8,30,31. Konseptuelt, er dette en sammenligning mellom høy belastning og lav belastning tilstand. Men det er ingen kvantifisering av lasten over protein i enten tilstand, og det kan være utilsiktet biokjemiske effekter av hemmer, slike tap av viktige bindende områder langs en F-utgangen filament. En annen tilnærming, gjelder for FAs, har vært å måle sum force anstrengelse på underlaget av FA bruker trekkraft force mikroskopi omtrentlig molekylær belastning og undersøke forholdet dynamikken i et enkelt protein i FA32. Mens denne tilnærmingen lar for kvantifisering av total makt, gir det ikke molecularly spesifikk informasjon. FAs består av over 200 ulike proteiner, hvorav mange kan bære belastningen33. Dermed måle det sum force produksjonen av en FA potensielt tilslører muligheten av flere kraft overføring og gir ikke pålitelig et mål av belastningen på et bestemt protein.
I motsetning til tidligere tilnærmingene i mechanobiology, bruk av bånd-baserte spenning sensorer kan direkte måling av laster oppleves av spesifikke proteiner i levende celler34,35,36. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer bånd-baserte spenning sensorer med FRAP-baserte mål av protein dynamikk. Vi kaller denne teknikken bånd-FRAP. Denne tilnærmingen kan samtidig måling av protein belastning og protein dynamikk, slik at vurdering av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er bånd-FRAP teknikken brukt til studiet av kraft-sensitive dynamikk av mekanisk koblingsfunksjonalitet protein vinculin37. Spenning sensorer har blitt utviklet for mange proteiner som er relevante i en rekke subcellular strukturer. For eksempel har sensorer blitt utviklet for vinculin34 og talin38,39 FAs, cadherins og catenins i AJs40,41,42, nesprin i kjernefysiske LINC komplekse 43, α-actinin44 og filamin36 i cytoskeleton og MUC-1 i glycocalyx45, blant annet46. Tilsvarende er FRAP en vanlig teknikk er brukt på mechanosensitive proteiner i fokal adhesjon8,31, adherens veikryss47, begrepsordbok cortex26og kjernen48. Fremover, bånd-FRAP teknikken skal være bredt aktuelt til noen av disse eksisterende sensorer eller nylig utviklet sensorer, slik at målinger av kraft-sensitive dynamikk i en rekke subcellular strukturer og sammenhenger. Mot dette formål gir vi en detaljert, generalisert protokoll for implementering av bånd-FRAP teknikk i disse forskjellige systemer. Forhåpentligvis aktiverer dette en rekke eksperimenter Klargjørende rollene av mechanosensitive regulerer kraft overføring og formidling celle atferd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x Objective NA1.35</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Dichroic Mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>T450/514rpc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom mTFP1 Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET485/20m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom mTFP1 Excitation Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET450/30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Venus Excitation Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET514/10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium</td>
			<td>Sapphire</td>
			<td>MC102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAPPA Calibration Slide</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>provided along with FRAPPA unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAPPA System with 515 nm Laser</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed Fluoro Dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide, Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP Pro Software</td>
			<td>SAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>LB10-NW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>LS/OF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph for Olympus</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Humidification System</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>130708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Heater Medium</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150819-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G Envelope Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRRL Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPax2 Packaging Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable Z Stage Warmer</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>403-1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus Emission Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-571/72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of force-sensitive protein dynamics in living cells using a combination of fluorescent techniques

Celler forstand og svare på fysiske signaler i miljøet ved å konvertere mekanisk stimuli til biokjemisk-detectable signaler i en prosess som kalles mechanotransduction. Et avgjørende skritt i mechanotransduction er overføring av styrker mellom de eksterne og interne miljøene. Å sende styrker, må det være en vedvarende, ubrutt fysiske koblingen laget av en rekke protein-protein interaksjoner. For en gitt protein-protein interaksjon, mekanisk belastning kan enten har ingen innvirkning på samspill, føre til raskere tilknytningene til samhandlingen, eller aften stabilisere samhandlingen. Forstå hvordan molekylær Last dikterer protein omsetning i levende celler kan gi verdifull informasjon om mekaniske staten en protein, igjen Klargjørende sin rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker for måling av kraft-sensitive protein dynamics enten mangler direkte målinger av protein belastning eller stole på målinger utført enhetskontroll mobilnettet. Her beskriver vi en protokoll for han selvmord resonans energi overføring-fluorescens utvinning etter photobleaching (bånd-FRAP) teknikk, som gjør at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler. Denne teknikken er potensielt gjelder enhver bånd-baserte spenning sensor, tilrettelegge studiet av kraft-sensitive protein dynamikken i rekke subcellular strukturer og ulike celletyper.

BÅND-FRAP består av en kombinasjon av to fluorescerende teknikker, bekymre og FRAP. Som vi fokusert på effekten av protein belastning, brukte vi bånd-baserte spenning sensorer34,46. Disse sensorene er ofte basert på en spenning sensing modul som består av to fluorescerende proteiner, som mTFP1 og VenusA206K, sammen med et flagelliform linker (figur 1A). Når modulen er plassert mellom hodet og b...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques at JoVE.com

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker

Her presenterer vi en protokoll for samtidig bruk av han selvmord resonans energi overføring-basert spenning sensorer for å måle protein belastning og fluorescens gjenoppretting etter photobleaching å måle protein dynamics slik at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler.

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Denne metoden kan svare på viktige spørsmål innen mekanobiologi, for eksempel hvordan krefter overføres og sanses i celler, så vel som mellom celler og deres miljø. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir tilgang til molekylær skalainformasjon om hvordan proteiner reagerer på mekaniske krefter i den opprinnelige konteksten til den levende cellen. Selv om denne metoden har blitt brukt spesielt til å studere fokal vedheft protein vinculin, det kan også brukes på andre mekanisk følsomme proteiner, som talin, kadheriner eller nesprin.Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, da riktig bildeoppsett er vanskelig, men nødvendig for analysens suksess. Start denne prosedyren med stabilt uttrykk for spenningssensoren konstruere i ønsket celletype, som beskrevet i tekstprotokollen. For å forberede substrater for cellesåing, skaff deg fire 35 millimeter glassbunnede retter.Arbeider i en celle kultur hette, i en 15 milliliter konisk rør, lage fire milliliter på 10 mikrogram per milliliter fibronectin i steril fosfat-bufret saltløsning, eller PBS. Snu forsiktig røret en gang for å blande og la løsningen sitte i fem minutter i cellekulturhetten. Pipette deretter en milliliter fibronectin løsning på hver glassbunnet tallerken.La fibronectinløsningen stå på oppvasken i en time ved romtemperatur eller over natten ved fire grader Celsius. Aspirer deretter fibronectinoppløsningen og skyll en gang med PBS. La en milliliter PBS på oppvasken til cellene er klare for såing.Etter å ha talt cellene, frø 30, 000 celler på hver fibronectin-belagt glass rett med riktig komplett media for et endelig volum på 1,5 milliliter. La cellene spre seg i fire timer etter såing. Ved to timers spredning, aspirer vekstmediet og skyll en gang med bildemedier.La det være 1,5 milliliter av bildemediet. Varm opp mikroskopet som beskrevet i tekstprotokollen før du begynner kalibreringen. For å kalibrere FRAP-laseren, må du først åpne laserkonfigurasjonsvinduet.Sett Belysningsinnstillingen på de riktige FRAP-belysningsinnstillingene for lasereksponering for prøven. Sett deretter Belysningsinnstillingen til belysningsinnstillingene som bare passer for bildebehandling av den som er godkjent fluorofor. Velg målet for å kalibrere under Koordinatsysteminnstilling.Fjern merket for Klikk kalibreringspunkter manuelt, og merk av for Vis bilder under kalibreringen. Sett oppholdstiden til 10 000 mikrosekunder og antall pulser til 100. Plasser kalibreringslysbildet, laget av ethidiumbromid forseglet mellom et glasssklie og en dekselslipp, inn i sceneadapteren med dekselet skli side ned.Bruk innstillingene for belysning av acceptor til å fokusere på overflaten av lysbildet, identifiserbar som fokalplanet med det lyseste signalet. Små defekter i belegget vil være synlige for å hjelpe til med å fokusere. Flytt lysbildet til et område med jevn fluorescens over bildeplanet.Klikk på Opprett innstilling for første kalibrering eller oppdateringsinnstilling for etterfølgende kalibreringer. Programvaren vil initialisere kalibreringsprosessen, automatisk bleking og oppdage plasseringen av bleket punkt. Sikre en vellykket kalibrering ved å vurdere det endelige bildet, som vil være et tre-tre rutenett av blekede punkter som skal fordeles jevnt og i fokus.Lagre kalibreringsbildet for fremtidig referanse. Fjern kalibreringslysbildet og oppbevar det på en trygg måte. Kalibrering bør utføres før du begynner hvert eksperiment, men trenger ikke å utføres mellom prøvene.Forbered mikroskopioppsettet for levende celleavbildning, helst med et oppvarmet stadium og mål, samt en karbondioksidkontroll. La det likevekte i 20 minutter. Plasser nå et av de genererte prøvene av celler som uttrykker spenningssensoren i mikroskopholderen for bildebehandling.La cellene likevekte i 10 minutter. For å sikre helsen til de avbildede cellene, oppretthold temperaturen ved 37 grader Celsius i bildekammeret. Bruk en peristaltisk pumpe til å passere fuktet 5% karbondioksid over prøvene ved 15 milliliter per minutt for å opprettholde pH.Åpne verktøyet Flerdimensjonal anskaffelse eller MDA, og konfigurer det med FRET-bildeparametere, inkludert de forskjellige filtersettene. Lagre denne MDA i eksperimentell mappe med navnet MDA_FRET_date. Konfigurer en annen MDA med FRAP-bildeparameterne, inkludert de forskjellige filtersettene, Timelapse-innstillingene og Journal for å pulsere laseren etter kjøp før blekemiddel.Lagre denne MDA i eksperimentell mappe med navnet MDA_FRAP_date. Velg Journal, Start opptak på verktøylinjen øverst på skjermen. Åpne MDA-vinduet, last inn MDA_FRET_date og trykk på Hent.Last deretter inn MDA_FRAP_date og trykk på Hent. Velg Journal, Stopp opptak på verktøylinjen øverst på skjermen på slutten av oppkjøpet. Lagre denne journalen i eksperimentell mappe med navnet på FRETFRAP_date og legg den til på en verktøylinje for enkel tilgang.Lukk MDA-vinduet. Naviger i eksemplet ved hjelp av bildeanskaffelsen under Hent, Hent med minimal eksponeringstid og nøytral tetthetsfilter for å identifisere interessecellene. Angi kontinuerlig autofokus ved å navigere til Enheter, Fokus.Fokuser prøven manuelt til den når riktig bildeplan. Klikk Angi kontinuerlig fokus, og vent til systemet skal justeres. Når systemet er justert, klikker du start kontinuerlig fokusering.Deretter finner du en celle som uttrykker spenningssensoren med klar lokalisering til en struktur av interesse og knipser et bilde. Tegn et rektangulært område av interesse, eller avkastning, for å markere hvor du skal bleke. Lagre denne avkastningsplasseringen.Nå initialisere FRETFRAP_date journal, som vil begynne oppkjøpet av FRET-bilder, etterfulgt av initialiseringen av FRAP timelapse. Gjenta disse trinnene til 10 til 15 bildesett er anskaffet. Analyser deretter FRET-FRAP-dataene som beskrevet i tekstprotokollen.Vist her er representative resultater for FRET-avbildning av vinculinspenningssensoren, etter segmentering og maskering for å isolere fokale adhesjoner. Spacial variasjon av vinculin belastning kan sees over cellen. FRAP-bildebehandling og analyse kan påvirkes av stabilitet i fokal vedheft.En fokal vedheft som forekom raskt i bildeperioden kan være vanskelig å spore nøyaktig. Ofte indikeres dette av en FRAP-kurve som inneholder diskontinuiteter og ikke-interaktiv. For en vill-type vinculin er det en omvendt sammenheng mellom proteinbelastning og omsetningshastighet, noe som indikerer at vinculin stabiliseres med kraft.Innføring av en mutasjon i vinculin for å påvirke bindingen til talin resulterer i en reversering av korrelasjonen, noe som indikerer at vinculin som ikke er i stand til å binde talin, destabiliseres med kraft. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å forberede prøver riktig, sikre at cellene uttrykker sensoren på endogene nivåer og velger bildeparametere nøye. Etter denne prosedyren kan andre metoder som immunofluorescence, måling av cellulær skaladynamikk eller utfordrende celler med ulike hemmere utføres for å svare på flere spørsmål som hvordan proteinet av interesse samhandler med andre subcellulære komponenter for å koordinere respons på kraft.