Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем метод доставки векторы экспрессии вирусных в мозга с помощью пленки Фиброин шелка. Этот метод позволяет адресности векторы выражения с использованием шелка/AAV покрытием оптического волокна, коническая оптических волокон и черепной windows.

Abstract

Стремление понять как нейронных цепей, обрабатывать информацию в целях поведенческих мощность привода значительно способствовало недавно разработанных оптических методов для манипулирования и мониторинга активности нейронов в естественных условиях. Эти типы экспериментов полагаться на двух основных компонентов: 1) имплантируемых устройств, которые обеспечивают оптический доступ к мозгу и 2) светочувствительные белки, которые изменить возбудимости нейронов или предоставить индикация активности нейронов. Существует ряд способов выразить светочувствительные белков, но стереотаксического инъекции вирусных векторов в настоящее время наиболее гибкий подход, потому что выражение может управляться с точностью, генетические, анатомические и временных. Несмотря на большую полезность вирусных векторов доставлять вирус на сайт оптических имплантатов создает многочисленные проблемы. Стереотаксическая вирусом инъекции требуют хирургических операций, которые увеличивают время хирургических, увеличить стоимость исследований и представляют опасность для здоровья животных. Окружающие ткани могут быть физически повреждены путем инъекций шприц и иммуногенные воспаления, вызванного резким доставки болюс высокий титр вируса. Выравнивание инъекции с оптическим имплантаты особенно трудно, при таргетинге малых регионов глубоко в головном мозге. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы описываем метод для покрытия различных типов оптических имплантатов с фильмов состоит из Фиброин шелка и аденоассоциированный вирусных векторов (AAV). Фиброин, полимер производный из кокона Тутовый шелкопряд, может инкапсулировать и защищать биомолекул и могут быть обработаны в формах, начиная от растворимых фильмов для керамики. При имплантированных в мозг, шелк/AAV покрытия выпустить вирус на стыке оптических элементов и окружающих мозг, вождение выражение точно, где она необходима. Этот метод легко реализуется и обещает значительно облегчить в vivo исследования нейронной цепи функции.

Introduction

За последнее десятилетие подготовил взрыв инженерии светочувствительные белков для мониторинга и манипулирования нейронной активности1. Вирусы предлагают непревзойденную гибкость для выражения этих инструментов optogenetic в мозге. По сравнению с трансгенных животных, вирусы являются гораздо проще для производства, транспортировки и хранения, что позволяет быстрое внедрение новейших инструментов optogenetic. Выражение может быть выполнено генетически различных нейрональных популяций, и вирусы, предназначенные для ретроградного транспорта может использоваться даже для выражения на базе нейрональных подключения2.

Protocol

Все эксперименты с участием животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденных Постоянным комитетом Гарварда по животных уход следующие руководящие принципы, описанные в низ нас руководство по уходу и использованию лабораторных животных. Взрослых мышей C57BL/6 обоего пола (6-15 недель возраста) были использованы для всех экспериментов.

1. получить водный Фиброин шелка

  1. Подготовка или приобрести водный Фиброин шелка (5-7,5% w/v).

2. смешать водный шелка с векторы AAV выражение

  1. Выберите выражение вектора AAV водить optogenetic белка или флуоресцентный индикатор выбо....

Representative Results

Для оценки успеха шелк/AAV фильмов в автошколах выражение, мы увлажненную животных 2-3 недель после имплантации и подготовлен срезы мозга от региона интерес. Флуоресценции изображения с меткой Флюорофор optogenetic белков (ChR2-рекламы ЯФП) предоставил определенную степень сам.......

Discussion

Использование шелк/AAV для выражения optogentic белков преодолевает ограничения подходов, которые в настоящее время используются. Хотя многие исследования успешно использовать AAV инъекции, чтобы выразить optogenetic белков, это сложно выровнять выражение кончик оптических волокон, регионы вокру.......

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить J. Васкес для иллюстрации, D. Каплан и C. ПРЕДА для реагентов и полезные рекомендации и в лабораториях B. Сабатини и C. Харви для изображений в естественных условиях . Микроскопия стало возможным M. Ocana и центром визуализации нейробиологии, частично поддержаны центр томографии нейронные как часть Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) P30 основной центр Грант (NS072030). Эта работа была поддержана путем фонд GVR Ходадад семьи, Нэнси Лурье знаки и низ грантов, NINDS R21NS093498, U01NS108177 и NINDS R35NS097284 для W.G.R и низ докторской стипендии F32NS101889 C.H.C.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Aqueous silk fibroinSigma5154-20MLAqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAVDrummond3-000-207Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implantsNarashigeMM-33Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk depositsAmScopeSM-6TX-FRL3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implantsAblazeN/A3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storageN/AN/ATo store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiberThorlabsFT200EMTØ200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
FerrulesKientecFZI-LC-230LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implantsVariousN/AFor detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implantsOptogenixLambda-BTapered fiber implants
GRIN lensesGoFotonCLH-100-WD002-002-SSI-GF3GRIN lenses
Small glass cranial windowsWarner64-0726 (CS-3R-0)Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windowsWarner64-0731 (CS-5R-0)Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windowsVariousN/AFor detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.

References

  1. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  2. Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144windows

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved