A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.
Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (Vm) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca2 + [Ca2 +]я увеличивается и последующей активации малых - и средней проводимости Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы.
Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca2 +]я и Vm в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.
Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети1. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca2 + ([Ca2 +]я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их ....
До проведения следующих экспериментов, обеспечить использование всех животных ухода и протоколы одобрен институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) и осуществляется в соответствии с Национальным Советом исследований »руководство для ухода и использования Лабораторных животных» (8-й издание, 2011) и руководящими принципами прибытия. IACUC Лома Линда университета одобрил все протоколы, используемые для этой рукописи для мужского и женского мышей C57BL/6 (возраст: 3 до 30 мес).
1. оборудование и материалы
Примечание: Подробная информация о материалы,....
Схематические демонстрации протокола, описанные выше показан на вложенные фигуры. Мозг, изолированных от молодых взрослых мужчины C57BL/6Н мышь (5 месяцев) показан на рисунке 1A. Задней мозговой артерии, тщательно изолированы от круг Уиллис, удалены без сое.......
В свете недавних событий6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca2 +] i и Vm лежащие в основе EDH .......
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Мы благодарим Чарльз Хьюитт за отличную техническую помощь при создании оборудования и предметов снабжения, необходимых для текущей протоколов. Мы благодарим Drs. Шон м. Уилсон и Кристофер г. Вильсон, от ЛСУ центр перинатальной биологии, за предоставление нам с дополнительным инвертированным микроскопом и электрометр, соответственно. Это исследование был поддержан национальными институтами здравоохранения грант R00-AG047198 (EJB) и лома Линда медицинской школы университета новый факультет начальных средств. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
MgCl2 | Sigma | M2670 | |
CaCl2 | Sigma | 223506 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Elastase | Sigma | E7885 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
DMSO | Sigma | D8418 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved