Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.

Abstract

Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (Vm) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca2 + [Ca2 +]я увеличивается и последующей активации малых - и средней проводимости Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы.

Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca2 +]я и Vm в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.

Introduction

Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети1. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca2 + ([Ca2 +]я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их ....

Protocol

До проведения следующих экспериментов, обеспечить использование всех животных ухода и протоколы одобрен институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) и осуществляется в соответствии с Национальным Советом исследований »руководство для ухода и использования Лабораторных животных» (8-й издание, 2011) и руководящими принципами прибытия. IACUC Лома Линда университета одобрил все протоколы, используемые для этой рукописи для мужского и женского мышей C57BL/6 (возраст: 3 до 30 мес).

1. оборудование и материалы

Примечание: Подробная информация о материалы,....

Representative Results

Схематические демонстрации протокола, описанные выше показан на вложенные фигуры. Мозг, изолированных от молодых взрослых мужчины C57BL/6Н мышь (5 месяцев) показан на рисунке 1A. Задней мозговой артерии, тщательно изолированы от круг Уиллис, удалены без сое.......

Discussion

В свете недавних событий6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca2 +] i и Vm лежащие в основе EDH .......

Disclosures

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgements

Мы благодарим Чарльз Хьюитт за отличную техническую помощь при создании оборудования и предметов снабжения, необходимых для текущей протоколов. Мы благодарим Drs. Шон м. Уилсон и Кристофер г. Вильсон, от ЛСУ центр перинатальной биологии, за предоставление нам с дополнительным инвертированным микроскопом и электрометр, соответственно. Это исследование был поддержан национальными институтами здравоохранения грант R00-AG047198 (EJB) и лома Линда медицинской школы университета новый факультет начальных средств. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GlucoseSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
NaClSigmaS7653
MgCl2SigmaM2670
CaCl2Sigma223506
HEPESSigmaH4034
KClSigmaP9541
NaOHSigmaS8045
ATPSigmaA2383
HClThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
Collagenase (Type H Blend)SigmaC8051
DithioerythritolSigmaD8255
PapainSigmaP4762
ElastaseSigmaE7885
BSASigmaA7906
Propidium iodideSigmaP4170
DMSOSigmaD8418
Fura-2 AM dyeInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Plexiglas superfusion chamber Warner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) Warner InstrumentsPM6 or PH6
Compact aluminum stage Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
MicromanipulatorSiskiyou MX10
Stereomicroscopes Zeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources Schott, Mainz, Germany & KL200, ZeissFostec 8375
Nikon inverted microscopeNikon Instruments Inc, Melville, NY, USATs2
Phase contrast objectives Nikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives Nikon Instruments Inc20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscopeNikon Instruments IncEclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 ) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
Vibration isolation tableTechnical Manufacturing, Peabody, MA, USA Micro-g
AmplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages Molecular DevicesHS-2A & HS-9A
Function generator EZ Digital, Seoul, South KoreaFG-8002
Data Acquision SystemMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Audible Baseline MonitorsAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA BM-A-TM
Digital Storage OscilloscopeTektronix, Beaverton, Oregon, USA TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMTMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAIonOptix Systems
Temperature Controller  Warner InstrumentsTC-344B or C
Inline Heater Warner InstrumentsSH- 27B
Valve Controller Warner InstrumentsVC-6
Inline Flow Control ValveWarner Instruments FR-50
Electronic Puller Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 or P-1000 
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)Warner InstrumentsG150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)Warner InstrumentsGC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)  ThermoFisher Scientific722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal SylgardLiving Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)World Precision Instruments555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm bladesFine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps FSTDumont #5 & Dumont #55

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143GCa2 K2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved