Одновременного измерения внутриклеточного кальция и мембранный потенциал в свеже изолированных и нетронутыми мыши мозгового эндотелия

Резюме

Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.

Аннотация

Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (V_m) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_я увеличивается и последующей активации малых - и средней проводимости Ca^{2 +}-активированный K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) каналы.

Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca^{2 +}]_я и V_m с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca^{2 +}]_я и V_m в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.

Введение

Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети¹. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов^1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их ....

протокол

До проведения следующих экспериментов, обеспечить использование всех животных ухода и протоколы одобрен институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) и осуществляется в соответствии с Национальным Советом исследований »руководство для ухода и использования Лабораторных животных» (8-^й издание, 2011) и руководящими принципами прибытия. IACUC Лома Линда университета одобрил все протоколы, используемые для этой рукописи для мужского и женского мышей C57BL/6 (возраст: 3 до 30 мес).

1. оборудование и материалы

Примечание: Подробная информация о материалы,....

Результаты

Схематические демонстрации протокола, описанные выше показан на вложенные фигуры. Мозг, изолированных от молодых взрослых мужчины C57BL/6Н мышь (5 месяцев) показан на рисунке 1A. Задней мозговой артерии, тщательно изолированы от круг Уиллис, удалены без сое.......

Обсуждение

В свете недавних событий^6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca^{2 +}] _i и V_m лежащие в основе EDH .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55