מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

Summary

כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה למעקב סמים מקיף המאפשר רזולוציית משופרת וזיהוי של לוחות גדולים של סמים של התעללות מטבוליטים שלהם, עם בקרת איכות המבוססת על הזרקת multisegment-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית.

Abstract

שיטות אנליטיות חדשות דרושים בדחיפות כדי לאפשר תפוקה גבוהה, מקיף עדיין והתרופות הקרנה, לנוכח משבר הסמים מדאיג, אופיואידים, מרשם לבריאות הציבור. בדיקות סמים שתן קונבנציונאלי המבוסס על מסך שני נדבכים מתכלה ואחריו ספקטרומטר מסה גז כרומטוגרפיה-טנדם (GC-MS/MS) או שיטת כרומטוגרפיה-טנדם נוזלי ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS) הם יקרים והם נוטים הטיה בעת היותו מוגבל ללוחות יישוב סמים ידוע של התעללות (מא ח). במסמך זה, אנחנו חלוקה לרמות שיטה משופרת למעקב סמים המאפשר הרזולוציה ואת גילוי של לוח המורחב של מא ח ו מטבוליטים שלהם בעת שימוש multisegment הזרקת-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית (MSI-CE-MS). מרובב הפרדות של דגימות שתן עשר עם בקרת איכות על-ידי לסה נ (< 3 דקות/דוגמה) בשילוב עם רכישת נתונים סריקה מלאה באמצעות זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-MS) תחת זיהוי מצב יון חיובי מאפשר הזיהוי ו ניתוק לרמות המומלצות כימות של מא ח לעיל. פתרון מעולה של סמים isomers, isobars, כולל הפרעות רקע, מושגות כאשר באמצעות MSI-CE-MS מרווח electrokinetic בין מקטעי הדוגמה, שם מדויק נוסחה מולקולרית/מסה יחד עם comigration של התאמת deuterated תקן פנימי וזיהוי של אחד או יותר מטבוליטים ביו-טרנספורמציה להקל על זיהוי מא ח על חלון זיהוי רחב יותר. בנוסף, ניתן לנתח דגימות שתן ישירות ללא אנזים deconjugation להקרנה מהירה ללא בדיקות מדגם מסובך. MSI-CE-MS מאפשר את המעקב של קשת רחבה של מא ח הנדרשת עבור טיפול בקרה של חולים בסיכון, לרבות המאשרת הדבקות תרופות לפי מרשם, חשיפת שימוש לא חוקי בסמים/החלפת הערכת מינון משטרים כאשר הדבר נדרש עבור התקדמות חדש ברפואה דיוק.

Introduction

עלייה מדאיגה לרעה, ההתמכרות אופיאטים לניהול של כאב כרוני מייצג איום גדל בריאות הציבור, עם יותר מ-70,000 מקרי יתר בסמים בארה ב מוערך ב- 2017¹. באופן דומה, שונים תרופות פסיכוטרופיות אחרות ניתנות גם נרחב של ילדים ומבוגרים צעירים לטיפול של חרדה, דיכאון, בעיות בריאות הנפש². כתוצאה מכך, בדיקות בשיטות, שפותחה רבות כדי להפוך את העבודה הרעלים משפטית, סמים בשתן יש חשיבות חיונית כדי טיפולית פיקוח על תרופות מרשם המועדים סובלנות תלות^3,4. זה דרוש על מנת להבטיח הדבקות יעילות טיפולית אופטימלית, בטיחות המטופל, תוך חשיפת החלפת פוטנציאליים, לרבות שימוש לרעה בסמים לא חוקיות או nonprescribed. כיום, בדיקות סמים בשתן של מא ח להסתמך על גישה משני נדבכים, הכוללת של מתכלה תחרותי הראשונית המסך באמצעות מכשירים בשלב של טיפול או אימונולוגיה מעבדה, ואחריו מבחן מאשרות עם ירידה לפרטים יותר בהתבסס על GC-MS/MS ו, יותר ויותר, LC-MS/MS⁵. עם זאת, immunoassays הם נוטים הטיה, כמו סרולוגיה נוגדנים לאגד nonspecifically קורסים סמים שונים כדי ליצור תוצאה הרב, שעורר מסך-חיובית, אשר מונע אמין וכימות של תרופות ספציפיות או סמים מורכבים תערובות⁶. בהקשר זה, בדיקות סמים בשתן מדויקות יותר נחוצים בדחיפות נתן את העלויות מופקעים של מסכי polydrug מקיף,⁷ כולל סמים מעצב, מוצרים סינטטיים שתן לחמוק קונבנציונאלי ממוקד מבחני.

הפרדות יעילות גבוהה בשילוב עם רזולוציה גבוהה MS (HRMS) באמצעות מאבחנים המוני תוף או orbitrap יש כבר הציע כאסטרטגיה nontargeted למעקב סמים בעידן של לוחות של מא ח^{8,9 polypharmacy והרחבת} . עם זאת, הפרדות LC קונבנציונליים הם איטי (> 15 דקות) בשל התקופה הארוכה • תנאי לקבלת הפתרון של מחלקות מגוונות מבחינה כימית של מא ח שלהם מטבוליטים באמצעות תוכניות • תנאי מעבר צבע, אשר מגביל את התפוקה מדגם להקרנה סמים שגרתית. לחלופין, שיטות ניתוח ישירה המבוססת על ה יינון (דסי) desorption¹⁰ וגם לייזר דיודה התרמי desorption (LDTD) מאפשרים מהר יותר סמים הקרנה ללא הפרדה¹¹. עם זאת, שיטות אלה יינון אמביינט נוטים הפרעות isobaric/isomeric בעת ניתוח דגימות שתן מורכבים, וכך מצריכים בדיקה מאשרות עצמאית.

המעבדה שלנו לאחרונה פיתחה פלטפורמה ההפרדה מרובבת כדי להגדיל את התפוקה הדגימה תוך שמירה על אמינות הנתונים של רזולוציה הפרדה יעילות גבוהה המבוססת על MSI-CE-MS¹². זרימות נתונים חדשניים יכולים מיועד ב- MSI-CE-MS המטבוליט nontargeted פרופיל (קרי, גליקומיקס) של אמצעי אחסון מוגבלת biospecimens, ואילו פקדים איכות (QC) לאפשר התיקון אצווה כנדרש עבור אוכלוסיה בקנה מידה גדול מחקרים¹³. במקרה זה, הפרדות מבוצעות באמצעות מאגר איזוקראטית ממס יינון המתרחשים בתנאים הממס מצב יציב כאשר משתמש ממשק נוזלי נדן קונבנציונאלי, אשר מאפשר לזריקות טורי של דגימות 10 או יותר בתוך יחידה הפעל להקרנה מהירה אך סלקטיבי של שיעורים מגוונים של מא ח ו שלהם מטבוליטים¹⁴. המוקד של מחקר זה היא כדי לתת תוקף נוסף של MSI-CE-MS לניתוח ישיר של דגימות שתן אותנטי נציג קבוצה של חולים בדיכאון קליני באמצעות שיטת "לדלל-ולירות, זה מונע את הצורך הידרוליזה אנזימטית¹⁵. בנוסף, יישום מרווח electrokinetic בין תקעים מדגם טורי MSI-CE-MS¹⁶ בוצעה נוספת משפרת את הרזולוציה של סמים שונים isomers/isobars, רקע, הפרעות בדרכי השתן ו/או קרוס-הפרעות בעת הקרנת לוחות גדולים של מא ח. כימות מוחלטת של מא ח ב דגימות שתן כאשר באמצעות התאמת deuterated סטנדרטים פנימיים (d-הוא) הוכח בעת שימוש MSI-CE-MS. גישה זו מקלה גם על זיהוי סמים, כמו גם להסיק מסקנה המיקום הנכון מדגם של המקרים מסך-חיובית בהשוואה תערובת לוח סמים-המומלץ הקרנת ברמה ניתוק שמתפקד גם ייחוס פנימי/QC בתוך הפעל אותו.

Protocol

בדיקות שתן עיוור נמסרו באדיבות על ידי ד ר Samaan זאניב מהמרפאה הפרעת מצב רוח בבית החולים סנט ג'וזף (המילטון, על, קנדה), שמחקרו אושרה על ידי מועצת המנהלים אתיקה המילטון מחקר משולב.

1. נוגדנים והכנות פתרונות לדוגמה

1. רקע אלקטרוליט הכנה
   1. להכין 50 מ של רקע אלקטרוליט (BGE) הדו-שבועיים, 1 מ' חומצה פורמית, pH 1.8, עם 15% acetonitrile וי/v כמו צירוף אורגניים.
   2. Aliquot מ 1.9 ל מרוכזים מלאי חומצה פורמית (26.5 ז) לתוך בקבוקון נפח 50 מ ל, להוסיף 7.5 mL של acetonitrile ושל 40.6 מיליליטר מים יונים כדי להביא את הנפח הכולל 50 מ. לאחר מכן, sonicate את הפתרון למשך 15 דקות, להעביר אותו בקבוק סטיריליים עם איטום צר.
2. הכנה נוזלי הנרתיק
   1. להכין 200 מ של נדן נוזלי פתרון שבועי, המורכב מ- 0.1% חומצה פורמית מתקפל 60: 40 (MeOH:H₂O).
   2. Aliquot µL 200 חומצה פורמית (26.5 מ' מניות) לתוך בקבוק המכיל 120 מ של MeOH ו- 80 מ של H₂O כדי להפוך נדן נוזלי של דגה אותו למשך 15 דקות.
   3. לאחר מכן, הוסף 10 µL של כל אחד של יונים הפניה הבאה, פורין hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), לתוך הנוזל נדן לספק אותות המוני מתמיד מ'/z 121.05087 ו- m/z . 922.00979, בהתאמה.
      הערה: יונים הפניה האלה לאפשר תיקון מסה בזמן אמת, גם לפקח על תופעות הדיכוי או שיפור יון מטריקס-induced אפשריות במהלך ההפרדה.
3. הכנה רגיל
   1. להכין פתרון רגיל המכיל תערובת לוח 84-סמים-3 x ניתוק קליני ההקרנה רמה (L6)¹⁴ 1 מ"ל של מתנול, תוך שימוש בסטנדרטים הסמים שנרכשו הספק כימית. להכין בנפרד תערובת של 48 התאמת התרופה פנימי deuterated סטנדרט (d-ISs) ריכוז גבוה יותר 10-fold מאשר התערובת 84-סמים ב 1 מ"ל של מתנול. בנוסף, להכין פתרון מניות המכיל 200 מיקרומטר של 4-פטור -L-פנילאלנין (F-Phe) ו- 3-כלורו -L-טירוזין (Cl-Tyr) ב 1 מ"ל של יונים H₂O.
   2. מבצע לדילול עושי התערובת הנ ל 84 תרופתיים (20 µL) ו- 48 יח-ISs (20 µL), כמו גם לדילול tenfold 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) ו- 3-chlorotyrosine (Cl-טיר, 10 µL) במטריצה שתן סינטטי מוסמך (40 µL) כדי להפוך סך נפח µL 100 בשפופרת צנטרפוגה 250 µL.
4. הכנה עקומת כיול חיצוני
   1. להכין עקומות כיול חיצוני חמש נקודות (כמפורט להלן), ארבע פעמים (n = 4) מעל טווח דינמי 20-fold באמצעות תערובת תקן 84-סמים ו- 48 מתוך שלהם d-ISs המתאימים שבוצעו בשלב 1.3.1. לדוגמה, עבור ביצוע עקומת כיול חיצוני חמש נקודות, ודא דילול תערובת 84 תרופתיים (L6, שלב 1.3.1) ל 2 - 4 - 10-, 20-, ו 40-fold, ואילו יש צורך להכין לדילול עושי התאמת לדילול tenfold 4-F-Phe (d-ISs (20 µL) 10 µL) ו- Cl-טיר (10 µL) הוא נוספים במטריצה שתן סינתטיים כדי להפוך את הנפח הכולל של 100 µL. במקרים כאשר d-IS תואמות אינה זמינה עבור תרופה מסוימת, השתמש 4-F-Phe בתור פונדקאית היא עבור נרמול נתונים.
      הערה: להימנע ההכללה של d-ISs נוספים שמפריעים קרוס (isobaric) עם אחרים DoA בתוך לוח אם הם לא לגמרי נפתרות על-ידי ההפרדה לסה נ.
5. הכנת הדוגמא שתן
   1. להפשיר בבוקר deidentified דגימות שתן נציג קבוצה של עשרה חולים בדיכאון קליני עם עבר של סמים ידוע מרשם. אחסן את דגימות שתן ב-80 מעלות צלזיוס לאחר אוסף עד שהם צריכים להיות הקרת לניתוח.
      הערה: להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה מרובים של שתן או אחסון מושהית בטמפרטורת החדר בעקבות אוסף המוזיאון עקב השפעתם על יציבות כימית של מטבוליטים DoA מסוימים, conjugates שלהם.
   2. מערבולת השתן בבוקר deidentified דוגמאות ל 30 s ו, ואז, centrifuge אותם עבור 1 דקות ב- x 14,000 g עבור שיקוע. לאחר מכן, aliquot 10 µL של הנ מעובד שתן, 10 µL של d-, ו- 5 µL של µL F-Phe/Cl-טיר ו- 25 של יונים H₂O ו מערבולת עבור 1 דקות (חזור על השלבים שהפקידים כדי להעריך את דיוק טכני). העברה של aliquot 20 µL של התערובת המתוארים לעיל בקבוקון פוליפרופילן לניתוח.

2. ההתקנה של מערכת CE-תוף-MS

1. ללא ציפוי נימי סיליקה התמזגו מיזוג פרמטרים
   1. ודא כי כל הסטנדרטים עקומות כיול חיצוני, בדיקות שתן מוכן בסעיפים 1.3-1.5 מופרדים באמצעות נימי מצופים פוליאימיד של סיליקה fused פתוח-צינורי ללא ציפוי קוטר פנימי של 50 μm, הקוטר החיצוני של 360 מיקרומטר, ו- a צינור קפילר האורך הכולל של 135 ס מ.
      הערה: כלי חותך יהלומים משמש כדי להבטיח נימים עקבית יותר ומפוקחים כדי להבטיח חתך סומק וחלק.
   2. הסר כ 7 מ מ של ציפוי פוליאימיד משני דיסטלי נימי הכיוונים, באמצעות מכונת חלון נימי בהפחתת דגימה carry-over, ולמנוע פוליאימיד פוטנציאליים נפיחות במגע עם הממס האורגני.
   3. ודא בולטות בערך 2 מ מ לשקע נימי מחוץ המחט ריסוס CE ולהתקין לים נימי במחסנית לסה נ על-ידי השחלת שתי פניות 360 °. לאחר מכן, בזהירות להתקין את מחסנית CE לספירה, למקם את המרסס לסה נ מתוך המקור יון בעת מיזוג של נים.
      הערה: חותכים ששקע נימי בעקביות כפי שהוא חיוני להבטחת הנוכחי כאשר מצמידים MS ספקטרומטריית electrospray יציב. שני מתזים שונים שימשו בעבודה זו: ריסוס לסה נ שימש את דגימת ולאחר ריסוס LC שימש את כיול מסה.
   4. הקפד לבצע את נימי מיזוג עם המרסס לסה נ לא ממוקם במקור יון. הכניסו המרסס LC המקור יון.
      הערה: זה מאפשר כיול מסה תוך הימנעות כל זיהום של הממשק נוזלי הנרתיק קואקסיאליים זה הוא לאחר מכן מצמידים את תוף-MS.
   5. תנאי נימים חדשים על-ידי בחירה בפונקציה סומק (940 mbar) על התוכנה של הספק נעשה שימוש כדי לשלוט המכשיר ולהגדיר את משך הסומק ב 30 דקות כל עבור ארבעה ממיסים שונים לפי הסדר הבא: מתנול, 1 M NaOH, יונים מים, BGE. הקפד לשים את המשאבה איזוקראטית המתנה במהלך תקופת מיזוג נימי.
   6. נגב המרסס CE-MS עם מגבון רקמות טבולים MeOH/H₂O כדי להסיר כל מרבצי מלח שיורית.
   7. לבצע את תחזוקה מונעת יומי של מערכת CE-MS לפני ניתוח הדגימות. השתמש מתנול כדי לנקות של CE אלקטרודה (על כניסת) אבל להשתמש של אלכוהול איזופרופיל ומים (50: 50) תערובת לנקות את הממשק CE-MS, וזה חשוב למנוע הצטברות מלח והגבלת פוטנציאל מדגם carry-over.
   8. להסיר את המרסס LC מתוך המקור יון והצב המרסס נקי עם נימי לאחרונה ממוזגים בממשק נוזלי הנרתיק קואקסיאליים עבור CE-MS.
   9. להפעיל את המשאבה איזוקראטית ולהחיל מתח של 30 kV למשך 15 דקות על מנת להבטיח כי פרופיל הנוכחי יציב CE מושגת לפני הניתוח שתן.
2. הזרקת ותנאי הפרדה באמצעות לסה נ
   1. פתח את תוכנת ספק המשמש לשליטה המכשיר כדי להגדיר את הפרמטרים CE ולבחור את preconditioning צעד. הגדר ריקון פונקציה 600 s וציין עמדה המבחנה BGE.
      הערה: chiller מים חיצוני ייתכן שיהיה עליך להיות מחובר מערכות לסה נ שאין מגש מדגם קירור תכונות, כמו זו נדרשת כדי למנוע אידוי לדוגמה בעת ניתוח גדול אצוות של דגימות בעל הגבלת נפח.
   2. להגדיר את פונקציית זריקה hydrodynamically להחדיר את הדגימות-mbar 100 עבור 5 s ולהזריק electrokinetically BGE מפרידי 30 kV עבור 75 s.
      הערה: תהליך זה חוזר על עצמו עם כל זריקה דוגמה (מתוך עמדה שונה המבחנה) ואחריו כרווח BGE (ממיקום המבחנה זהה), זה מתבצע באופן אוטומטי בתוך תוכנית בשיטה על התוכנה עבור סכום כולל של 11 דגימות דיסקרטית ניתח ב אותו להפעיל בעת שימוש בתבנית של MSI. לנתח דגימות שתן 10 בסדר אקראי לאחר תערובת 84-לוח סמים-שרשם ההקרנה רמת מוזרק כמו העמדה הדגימה הראשונה עבור כל הפעלה MSI-CE-MS.
   3. הגדר את החלת מתח עד גיל 30 kV, מחסנית טמפרטורה 25 ° C, וגם את זמן ריצה הכולל יהיה 40 דקות באמצעות לוח הזמנים, להחיל מעבר צבע בלחץ של mbar 2/min מ 0 דקות על 40 דקות במהלך ההפרדה.
      הערה: לחץ הדרגתי מוחל במהלך ההפרדה כדי לאפשר • תנאי של איטי-מעביר סמים, הכולל כמה בנזודיאזפינים חלש, בסיסי וסמים נייטרלית/חומצי (למשל, פרצטמול, ברביטורטים). עם זאת, מא ח הבסיסי ביותר של מטבוליטים שלהם נודדים כמו קטיונים בתוך 25 דקות, כולל אמפטמינים, אופיאטים מעמדות אחרים של אלקלואידים.
   4. לאחר השלמת רכישת המדגם, הקפידו לשטוף את נימי, בלחץ נמוך (50 mbar) עם BGE עד למחרת. אחרת, יש לשטוף את נימי עבור 600 s, בלחץ גבוה (900 mbar) עם מים, ולאחר מכן עבור 600 s עם האוויר, ואחסן אותו בעל ריסוס עד לשימוש הבא.
3. משאבה איזוקראטית, נדן נוזלי
   1. השתמש משאבה של אינסוף איזוקראטית ו- Degasser של אינסוף למסור הנוזלי נדן (מתקפל 60: 40 MeOH:H₂O עם 0.1% חומצה פורמית וי/v) בקצב של 10 µL/min למיכל הריסוס CE-MS.
4. הגדרות תוף-MS
   1. ודא כי תוף-MS, עם מקור יון קואקסיאליים ספקטרומטריית electrospray נוזלי הנרתיק, גז חנקן מחוממת, מצויד עם יחידת לסה נ.
   2. לנתח את תוף-MS תחת זיהוי יון חיובי שהשתרעו מסה של m/z 50-1700, עם קצב רכישת ספקטרום/500 ms. ודא את הפרופיל והן את centroid הנתונים מאוחסנים בתבנית קובץ ".d".
   3. להגדיר את התנאים יינון ספקטרומטריית electrospray להיות: מתח Vcap ו זרבובית ב 2,000 V הגז מפוחים בבית 10 psi, הגז ייבוש וכשאשר 8 L/min ב 300 ° C, עם זרם הגז מעטפת של 3.5 L/min-195 מעלות צלזיוס. בנוסף, קבע את הגדרות מתח MS של fragmentor, מקפה, Oct1 RF 120, 65 של 750 V, בהתאמה.
      הערה: Vcap ו זרבובית מתח, כמו גם גז מפוחים היו כבויים במהלך רצף הזרקה מדגם טורי בשימוש MSI-CE-MS, אבל ספקטרומטריית electrospray תוכננה להיות מופעל שוב 1 דקות לאחר החניכה ההפרדה electrophoretic כדי למנוע הנוכחי שגיאות עקב suctioning אפקטים.
   4. ביצוע כלי בקרה ונתוני הרכישה באמצעות התוכנה של הספק (טבלה של חומרים).
5. ניתוח נתונים
   1. לנתח את הנתונים MSI-CE-MS באמצעות התוכנה של הספק, כולל עיבוד, נתונים החלקה, ואת השילוב של יון שחולצו electropherograms (EIEs) עבור נציג DoA מטבוליטים שלהם.
   2. פתח את תוכנת והגדר את הפרמטרים הבאים.
      1. תחת chromatograms, בחר את תבנית הנתונים החילוץ, ואת chromatogram של מסה נתונים ספקטראליים לעצב למצב פרופיל .
      2. בחר Savitzky Golay ריבועית/מעוקב תחת פונקציית החלקת ו פונקציה רוחב 15 נקודות.
      3. לאחר מכן, לחץ על שילוב (MS), להגדיר האינטגרטור להיות Agile, ובחר את המספר המרבי של פסגות גבול ה-11 הגדול תחת שיא מסננים.
      4. לחץ על תצוגה, לחץ על רשימת שיא אינטגרציהולאחר בחר את שיא זמן השמירה (RT), באזור השיא, שיא הגובה, יחס אות לרעש (SNR).
      5. שמור את הפרמטרים האלה תחת שם בשיטה יחודית. שיטה זו חל התהליך ולפרש כל ערכת נתונים.
         הערה: טבלת סיכום עם מספר שיא של RT, אזור הפסגה, גובה, SNR את מציגה בצד ימין. לבצע נרמול נתונים עבור RT נמדד ואזור שיא משולב עבור כל DoA כדי גם ההתאמה d-הוא או (אם לא זמין) F-פה כדי לשפר את דיוק אנליטית.

3. ניתוח של בדיקות שתן, עקומות כיול חיצוני

1. תצורות שונות הזרקה טורית בשימוש MSI-CE-MS
   1. עבור התצורה הזרקה מדגם טורי הראשונה, בשימוש כדי להדגים סמים איזומר/isobar רזולוציה (איור 1 א'), ודא כי חמש חזר על ההזרקה מתבצעת על תערובת של סטנדרטים 84 סמים עם d-הוא 4-F-Phe/Cl-טיר, ואחריו שישית זריקה, איזו היא דוגמה ריק בשתן סינתטי, חמש זריקות נוספים של התערובת סמים רגיל.
   2. עבור תצורת הזרקה מדגם טורי השני, בשימוש כדי להדגים את הגילוי של מא ח בדגימות שתן בודדים מחולים עם מרשם ידוע (איור 2 א), ודא התקע המדגם הראשון הוא תערובת של תערובת תקן 84-סמים- 1 x ניתוק ההקרנה רמה (בקרה חיובית) ואחריו זריקה אקראי של דגימות שתן מדולל 10 מחולים: #293 #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183, #50.
   3. עבור תצורת הזרקה מדגם טורי השלישי, נעשה שימוש כדי להדגים הרכישה של עקומות כיול חיצוני יחיד להפעיל, להבטיח כי פתרונות calibrant מא ח מוכנים מעל טווח דינמי ליניארי 20-fold המקביל 0.25 x, 0.5 x, 1 x, 2.5 x, ו- 5 x רמות ריכוז ניתוק, יחד עם התאמת d-IS F-Phe/Cl-טיר שהם נוספים במטריצה שתן סינתטי (n = 4).

תוצאות

MSI-CE-MS מאפשר הזרקה טורית של דגימות דיסקרטית עשר או יותר בתוך רצף יחיד, אשר משפר באופן משמעותי את התפוקה (< 3 דקות/המדגם) ללא שינויים פלייבק מסובך, תוכניות מיתוג עמודה או תשתית יקר השקעות (איור 1 א'). סדרות מתחלפים של זריקות hydrodynamic של המדגם, מרווח electrokinetic של BGE מתבצע בתוך נימי סיליקה התמזגו שלא שונתה, איפה סונאל הפרדות electrophoretic של יונים להתרחש בתנאים אלקטרוליט חומצי חריפה (pH 1.8). ממס יינון מתרחשת גם בתנאים מצב יציב. במקרה זה נוזל הנרתיק קואקסיאליים, עם calibrant המוני, משמש כממשק CE-MS תחת זיהוי מצב יון חיובי עם יון מינימלית תופעות הדיכוי או שיפור כפי המנוטרת על-ידי האות יונים calibrant המונים. תוף מייצג HRMS חזקים אך חסכוניים עם רכישת נתונים מהירה אידיאלי עבור יישומי מעקב ההקרנה nontargeted/סמים בעת שימוש MSI-CE-MS. לדוגמה, רזולוציה מרשימה מושגת שונים isobaric/isomeric מא ח ו מטבוליטים שלהם, כולל isomers מבנית של שלוש isomers מבנית אופיואידים, כלומר norhydrocodone, הידרומורפון ו מורפיום (איור 1B). במקרה זה, 30 נפתר פסגות מ 10 דוגמאות עצמאית של תערובת סמים מזוהים ללא מדגם carry-over. פקד ריק/שלילי שתן שתן סינתטי כלולה גם בתוך הסדרה הזרקה טורית (לדוגמא מיקום #6). בנוסף, שני אחרים isobaric אופיאטים, כלומר 6-acetylmorphine (מטבוליט לא פעיל הרואין) ו נלוקסון (אנטגוניסט קולטני אופיואידים בשימוש לטיפול חירום של אופיואידים יתר) נפתרות לחלוטין כמו 20 פסגות ברורים עם נתוני סריקה מלאה (רכישה איור 1C). באופן דומה, שני isomers מיקומיים אמפטמין מזוהים באופן מלא ב- MSI-CE-MS לבידול מטאמפטמין איליקיט התעללות פוטנציאל ניצול לרעה של phentermine, ממריץ הקבוע המשמש מדכא תיאבון עבור הרזיה.

איור 1: סדרה של יון שחולצו electropherograms (EIE) עבור נציג מא ח isomers/isobars הנפתרות על-ידי MSI-CE-MS על-ידי ניתוח ריק בתוך רצף יחיד ודוגמאות עשר. (א) סכמטי של MSI-CE-MS זה מתאר את תצורת הזרקה טורית משמש לוח 84-DoA בשתן סינתטי. שיטה זו ההפרדה מרובבת משתמשת סדרות מתחלפים של זריקות hydrodynamic של 11 ריק ודוגמאות דיסקרטית עם זריקה electrokinetic של מאגר ליזום ההפרדה electrophoretic סונאל של יונים, ואחריו נתונים סריקה מלאה הרכישה על ידי תוף-MS עם זיהוי מצב יון חיובי. Isomers אופיואידים קבוצה פונקציונלית isobaric (B) 3 (m/z 286.1438), מופרדים על ידי לסה נ, הכוללת 30 נפתרה פסגות מ 10 זריקות מדגם בדיד, כולל norhydrocodone, הידרומורפון מורפיום. (ג) 2 isobaric אופיואידיות, שלהם מטבוליטים (m/z 328.1543), מופרדים על ידי לסה נ, הכוללת 20 נפתרה פסגות מ 10 זריקות מדגם בדיד, כולל 6-acetylmorphine (המטבוליט הרואין) ונלוקסון. (ד) 2 isobaric קבוצה פונקציונלית אמפטמין isomers, מופרדים על-ידי לסה נ, הכוללת 20 נפתרה פסגות מ 10 זריקות מדגם בדיד, כולל phentermine ו מתאמפטמין. בכל המקרים, פקדים שתן שלילית/הציג במיקום מדגם השישי ב- MSI-CE-MS סרק שאין ראיות זניח של מדגם carry-over. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

למסך מא ח, תצורה הזרקה טורית של MSI-CE-MS בשימוש תערובת לוח 84-סמים-המומלץ הקרנת רמות ריכוז ניתוק (כמו תנוחת הזריקה הראשונה עבור כל הרצפים) ואחריו ניתוח אקראי של שתן נציג 10 דגימות מחולים בדיכאון קליני עם היסטוריה ידועה מרשם. למשל, הקרנה חיובי במבחן התוצאה עבור מתדון (m/z 310.2165) מהמטופלת #208 (איור 2 א) הסיק על ידי זיהוי לשיא אות גדולה (שמקורם הזרקת #9) אשר comigrates עם מתדון-d3 עם נמוך המוני שגיאה (< 5 ppm). אין אותות אחרים מזוהים כל דגימות שתן אחרים בתוך אותו לרוץ. ריכוז מתדון חורג 13 x המגבלה ניתוק המומלצת בעת השוואת יחס התגובה שלו נמדד יון המדגם (הזרקת #9) עם ההתייחסות לסמים התערובת/QC (הזרקת #1), על-ידי גורם לדילול שתן fourfold. לפיכך, תוצאה זו מאשרת את הדבקות של החולה טיפול ותחזוקה מתדון. ראיות של צריכת אמפטמין nonprescribed (איור 2B) מוצג על ידי רמות גבוהות אמפטמין (m/z 136.1121) אשר התגלתה רק אצל חולה אחד (החולה #50, הזרקת #11) תוך הפעלה MSI-CE-MS. הריכוז נמדד חריגה מעט את רמות ניתוק המומלצת (1.3 x). זה comigrates עם אמפטמין-d5 והיה שגיאת מסה נמוכה עם גפרור המדורגים עליונים נוסחה מולקולרית. תוצאה חיובית עבור venlafaxine נוגדות דיכאון (m/z 278.2115), מעכב ספיגה חוזרת סרוטונין סלקטיבית-נוראדרנלין, הוא הראה גם אצל המטופל #281 (הזרקת #6). במקרה זה, הריכוז חורגת רמות ניתוק המומלצת (15 x), זה מזוהה על ידי שלו מדויק מסה - או נוסחה מולקולרית-match, יחד עם comigrating venlafaxine-d6 (איור 2C). הקריטריון האחרון זה אינו מתקיים עבור isobar לא ידוע שמזוהה גם בתוך האיתור EIE, אשר מדגיש את הצורך התראה כאשר להסתמך אך ורק על המסה מדויק. בנוסף, זיהוי סופי pregabalin מרשם, אשר היא מרשם לטיפול בכאב נוירופטי, כמו גם חרדה מוכללת, הוא הראה גם לחולה #309, בהתבסס על הריכוז גבוהות בצורה דוחה שלו (64 x) מעל המומלץ רמות ניתוק (איור דו-ממדי). עם זאת, אינו מזוהה של תשעה אחרים דגימות שתן החולה מנותח בתוך אותו לרוץ. דומה בשאר המקרים מסך-חיובית, הזרקת #4, comigrates עם pregabalin-d6, אשר נכלל כל דגימות שתן נותחו על ידי MSI-CE-MS.

איור 2: סדרה של יון שחולצו electropherograms (EIE) עבור נציג מסך-חיוביות שתן סמים תוצאות הבדיקה של עמית של 10 חולים בדיכאון קליני כמו אישר מתי מומלץ להשתמש MSI-CE-MS, הכולל לוח 84-סמים- רמת ניתוק, להזריק לפי העמדה הראשונה של הזרקה מדגם הגשה ייחוס פנימי/QC. (א) EIE כיסוי המתאים מתדון-d3, אשר comigrates מתדון, המדגיש את דגימת שתן אחת בלבד (הזרקת עמדה #9) יש ריכוזים גבוהים מתדון העולה על רמת ניתוק. (B) EIE כיסוי המתאים אמפטמין-d3, אשר comigrates עם אמפטמין, המדגיש את דגימת שתן אחת בלבד (הזרקת עמדה #11) יש ריכוזים מעל רמות ניתוק. (ג) EIE כיסוי המתאים venlafaxine-d6, אשר comigrates עם venlafaxine, המדגיש את דגימת שתן אחת בלבד (הזרקת עמדה #6) יש ריכוזים מעל רמות ניתוק. (ד) EIE כיסוי המתאים pregabalin-d6, אשר comigrates עם pregabalin, המדגיש את דגימת שתן אחת בלבד (הזרקת עמדה #4) בגסות הניחן ריכוזים העולה על רמות ניתוק. דגימות שתן כל נותחו ישירות לאחר עושי לדילול במים יונים יחד עם התוספת של ההתאמה d-(כאשר היא זמינה). תוצאה חיובית מסך ב- MSI-CE-MS תואם את הסם comigrates עם d-ISs עם השגיאה מסה נמוכה (< 5 ppm) ואת הנוסחה המולקולרית הנכונה, הריכוז אשר חורג שרשם הוא לנתח תוך הפעלה זהה כמו ייחוס פנימי/QC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כימות מוחלטת של מא ח ו שלהם מטבוליטים מושגת גם על ידי MSI-CE-MS בהתבסס על עקומות כיול חיצוני, באמצעות הפניה calibrant תקנים עבור מא ח נרכש במהירות בתוך רצף יחיד כי. למשל, דילול טורי של 84-סמים calibrant תערובת יחד עם ההתאמה d-נמצא ריכוז קבוע מספק ניתוח כמותי אמין בדגימות שתן מורכבים. זה מפצה על פוטנציאל יון מטריקס-induced דיכוי או שיפור אלא גם עבור וריאציות בגוף הגיאומטרי ההזרקה ב נימי בין הדגימות. במקרים כאשר התאמה d-IS לא זמין מסחרית או העלות אוסרני עבור DoA מסוימים, פונדקאית היא משמשת עבור נרמול נתונים, כגון d-IS מ בתוך הסמים באותה הכיתה או של סינתטי שתן לא נמצא בתוך מתחם (F-Phe), כפי שמתואר בעבר ¹⁴. נציג EIEs ועקומות כיול חיצוני עבור האוקסיקודון מוצגים באיור 3 א, ב'. ועבור citalopram ב איור 3C, D. אלה נרחב ניתנות משככי כאבים, תרופות נוגדות דיכאון, בהתאמה, עם פוטנציאל התעללות. יון היחסי התגובה יחסי להתאמת שלהם d-זה נמדדים. במקרה זה, תצורה הזרקה טורית של MSI-CE-MS, הכוללת חמישה calibrants סמים שונים, הם ניתחו ב כפילויות בתוך ריצה אחת יחד עם שתן סינתטי ריק. קמצנים ליניאריות (R² > 0.990) על פני ריכוז 20-fold טווח הושגה עם רגישות מספקת עבור הגילוי של הרוב המכריע של מא ח ו שלהם מטבוליטים (קרי, אלקלואידים cationic) בתוך הפאנל 84-סמים ¹⁴. בכל המקרים, מטבוליטים סמים מזוהים כפי שלהם protonated מולקולרית יון [MH⁺] מעל שלהם ניתוק ההקרנה מגביל (> 50 ng/mL), למעט תרופות מסוימות חומצי/נייטרלי שיש על יעילות יינון המסכנה תחת מצב יון חיובי, כמו קנבינואידים (למשל, THC-COOH), ברביטורטים (למשל, secobarbital) ו קרבמאטים (למשל, carisoprodol).

איור 3: סדרה של יון שחולצו electropherograms (EIE) עבור כימות של מא ח נציג. פעולה זו מתבצעת על-ידי יצירת עקומות כיול חיצוני המבוסס על יחס התגובה שלהם יון יחסית עם d תואמות-נגמר טווח דינמי ליניארי 20-fold. (א) לשכפל הזרקה של עקומת כיול חמש נקודות עבור אוקסיקודון calibrants יחד עם אוקסיקודון-d3, ריק. (B) עקומת כיול חיצוני עבור אוקסיקודון, בעקבות רגרסיה ליניארית להפיק רגישות (שיפוע), ליניאריות (R²), עם קווי שגיאה המייצג ±1σ (n = 4). (ג) לשכפל הזרקה של עקומת כיול חמש נקודות עבור citalopram calibrants, יחד עם citalopram-d6 וריק. (D) עקומת כיול חיצוני עבור citalopram, בעקבות רגרסיה ליניארית להפיק רגישות (שיפוע), ליניאריות (R²), עם שגיאה ברים וייצוג ±1 SD (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הפרדות כרומטוגרפי המקובלת בדרך כלל להסתמך על זריקת מדגם יחיד לכל הפעלה, אשר לאחר מכן ואחריו • תנאי מעבר ליישוב עמודה שפוץ ותערובות סמים מורכבים. דרישות אלה באופן מהותי להגביל את התפוקה מדגם והחובה מחזור אפילו בעת שימוש אופטימלי של תוכניות מיתוג עמודה. בהקשר זה, בדיקת שתן בנפח גבוה סמים במקום העבודה, טוקסיקולוגיה, או טיפולית ניטור יישומים על-ידי GC-MS/MS, יותר ויותר, LC-MS/MS הן ובכך שבוצעו במקביל אך מעדיפים משמש בשכבה השנייה או מאשרות בדיקה מתי הצורך (כלומר, הקשר המשפטי או הרפואי). זאת בשל השקעות הון גבוה יותר בוקר, עלויות התפעול, כמו גם סיבוכים עם ניתוח נתונים בעת השוואה בין דגימות מנותח על פני פלטפורמות מרובות פלייבק במרחק המעבדה מוסמכים. כתוצאה מכך, immunoassays עדיין נשארים השיטה העיקרית להקרנה סמים שגרתית למרות היותו נוטה שווא-תוצאות חיוביות ו- false-שליליות בקרב חוגים רבים סמים, עם גישה מוגבלת נוגדן ריאגנטים עבור סמים מעצב המתעוררים. מחקרים קודמים הראו כי הפרדות מרובבת מבוסס MSI-CE-MS להציע פתרון פשוט כדי לשפר את התפוקה הדגימה עד סדר גודל אחד. בנוסף, גישה זו מאפשרת על עיצוב האתר של זרימות עבודה נתונים חדשניים עבור גילוי סמן עם אמינות גבוהה נתונים המבוססת על יישום תיקון יעיל אצווה בקרת איכות^12,13,14. עם זאת, המבוא של 10 או יותר טורי זריקות hydrodynamic MSI-CE-MS מקצר את אורך נימי נדרש לשמור על יעילות גבוהה הפרדות, אשר עלול לסכן את מידת הבררנות בעת ניתוח מא ח ו שלהם מטבוליטים ב שתן.

במסמך זה, הצגנו זריקת electrokinetic BGE לאחר כל הזרקה מדגם hydrodynamic, כך ההפרדה מנצל אורך מלא נימי (120 ס מ), ובכך שיפור הרזולוציה של תרופה חשובה isobars/isomers בעת שימוש סריקה מלאה נתוני הרכישה על ידי תוף-MS (איור 1 א'). בהשוואה האחרונות ח¹⁴, רזולוציה טובה יותר מושגת עבור מספר חשוב isobaric/isomeric מא ח ו מטבוליטים שלהם, אשר חיוני בעת הקרנת לפאנלים תרופות גדולה. למשל, ברזולוציה של isomers קבוצה פונקציונלית/מבנית חשובה מספר מומש, כולל שלושה מקביל אופיואידים סמים/מטבוליטים (איור 1B), isobars אופיואידים לא קשורים שני (איור 1C) שני מתאמפטמין isomers לפי מיקום (איור 1D). בכל המקרים, מדגם carry-over של הזרקה טורית של פתרונות calibrant שונים בתוך אותו להפעיל אינו משמעותי כפי שאושר על-ידי שתן שלילית שליטה/ריק. בנוסף, רזולוציה משופרת גם ממומש עבור מספר קרוס-הפרעות מעורבים מסוימים d-ISs עם תרופות isobaric בתוך הלוח, כגון cotinine-d3 ו- 3,4-methylenedioxyamphetamine (מד א), EDDP-d3 imipramine, norfentanyl-d5 ו קטמין, קודאין-d6 ו sertraline, קוקאין-d3, זולפידם. התוצאה היא להרחיב אחרים הפרעות isobaric בתוך הפאנל סמים שנפתרו יותר במחקר זה (לדוגמה, noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/methylphenidate), כמו גם הפרעות בדרכי השתן רקע עיקריים (למשל , במקור קטע יונים של קריאטינין עם אמפטמין)¹⁴. אכן, גישה שני פרמטרים אורתוגונלית כדי לספק זיהוי בשם ספציפי ההגעה הינה קריטית הפחתת שווא-תוצאות חיוביות בשל הפרעות isobaric, כלומר מדויק המוני בשילוב עם comigration עם d-ISs. בנוסף, הגילוי של מטבוליטים biotransformed אחד או יותר של הסם האב בתוך באותה דגימת זרע, כגון glucuronide hydroxylated, demethylated או נפגע סמים conjugate(s), מוסיף עוד יותר אמון כלפי סמים זיהוי תוך הרחבת חלון לצורך זיהוי.

רמות ניתוק מומלץ להקרנה שתן לסמים להשתנות נרחב עבור מחלקות שונות של מא ח (החל מ-50 ועד 1,000 ng/mL) בהתאם פרמקוקינטיקה שלהם, רעילות הפרעות רקע, על מנת לצמצם הטיה שיטה המבוססת על הנחיות מ התמכרות לחומרים ממכרים ושירותי בריאות הנפש המינהל (SAMHSA)¹⁴. הפוטנציאל של MSI-CE-MS לאתר ולזהות שיעורים מגוונים של מא ח ישירות בשתן עם דוגמה מינימלית רעלני הוחל על קבוצה של חולים בדיכאון קליני עם רישום במרשם ידוע. זיהוי מוחלט של מתדון (רשם), אמפטמין (nonprescribed/אסורים), venlafaxine (מרשם) pregabalin (מרשם) דגימות שתן מדולל, עדיין nonhydrolyzed, הודגם בעת שימוש MSI-CE-MS. זה היה מבוסס על השוואה ישירה של תרופה זוהה בעמדה הזרקת ספציפי ביחס לתערובת 84-סמים הציג במקום המדגם הראשון-המומלץ הקרנת ברמה ניתוק אשר משמשת ייחוס פנימי/QC, בקרה חיובית (איור 2). בנוסף, כימות סמים מוחלטת אפשרית כאשר באמצעות עקומות כיול חיצוני (איור 3) המבוססים על היחס התגובה יון שנמדד עבור תרופה יחסית שלה d-הוא. בניגוד בהפרדות כרומטוגרפי ביותר, ואין כל השפעה דאוטריום להשפיע על ההעברה הבדלי הזמנים בין d-הוא סמים nondeuterated שלה מאז ברשותם מקביל mobilities electrophoretic בתמיסה חינם ב- CE. ואכן, אופן הפעולה של ההעברה של מא ח הוא המודל במדויק לספירה, בהתבסס על מבנה היסוד physicochemical מאפיינים/כימי שלהם, כלומר נפח מולקולרית ו יעיל תשלום (pK)¹⁴. מאז תרופות רבות גם עוברות מטבוליזם משני משמעותי לפני הפרשה בשתן (למשל, מורפיום glucuronide), ניתוק ההקרנה רמות לחייב התאמה כמו שלהם נמדדו ריכוזים נמוכים יותר הצפוי בהשוואה שיטות לנצל הידרוליזה אנזימטית לגילוי סמים הכולל. אחד היתרונות המרכזיים של "לדלל-ויורה" שתן בדיקות סמים, מלבד הפחתת עלויות/שעה, מדגם טיפול, ו דעה קדומה פוטנציאליים או אצווה וריאציות עקב הידרוליזה אנזים לא הושלמה, הוא הרב, שעורר מסך-חיוביות במקרים נוספים מאושרות על-ידי הזיהוי של מטבוליטים סמים קשורים אחד או יותר בתוך באותה דגימת זרע. זה גם מספק תובנות עמוקות יותר התרופה פרמקוקינטיקה ודרישות מינון אופטימלי עבור חולים בודדים תוך שיפור את הזיהוי עבור metabolizers "מהיר" או רשם/סמים עם מחצית החיים הקצר. בנוסף, comigration עם ההתאמה d-מחזות שתי פונקציות חשובות עבור סמים אמין הקרנת כאשר משתמש MSI-CE-MS — כלומר, מזהה המיקום הזרקה מדגם המדויק (קרי, החולה #) בעת תיקון גם על ההבדלים יון אמצעי אחסון עבור שיפור דיוק ודיוק תגובות הזרקה.

עתיד לעבוד שואפת לפתח כלי תוכנה מותאמת אישית כדי להקל על עיבוד נתונים אוטומטי של הפרדות מרובבת מצמידים HRMS כנדרש עבור בדיקות עם QC/אבטחת איכות סמים בשתן בנפח גבוה. אימות קפדני של MSI-CE-MS להקרנה רחבת ספקטרום של מא ח גם ייחקר בקרב קבוצה גדולה של חולים בסיכון גבוה על מנת להעריך באופן אובייקטיבי תרופות מרשם הדבקות ואת הפוטנציאל לשימוש לרעה/החלפת עלול לסכן טיפול יעילות, בטיחות המטופל, ו/או הערכה פסיכיאטרית/אבחון. ניתוח משלימים של מחלקות חומצי/anionic של מא ח ו מטבוליטים שלהם גם יבוצעו על ידי MSI-CE-MS בתנאים אלקליין עם יון שלילי במצב זיהוי כנדרש להקרנה מקיף של הקנבינואידים טבעי/סינתטיים. זה חשוב לתת את ההשלכות בריאות הציבור מתנשא לגליזציה של סמים פנאי קלים על פני מספר מדינות בארה ב ובקנדה. היתרון העיקרי של סריקה מלאה נתוני הרכישה על ידי תוף-MS הוא ניתוח רטרוספקטיבי של דגימות יכול להתבצע גם כאשר דגימות שתן הופכות ללא זמינות לבדיקת מעקב, ואילו סגנון חיים או חשיפות תזונתיים אחרים יכול להידרש טוב יותר להבין תגובות דיפרנציאלית על טיפול תרופתי. לסיכום, שיטת מעקב מהיר אך מדויקת של סמים, על-ידי MSI-CE-MS מציעה יתרונות משמעותיים קונבנציונלי immunoassays יישוב, וכן אינפוזיה ישירה/הסביבה שיטות יינון-MS/MS כי הם נוטים הפרעות/הטיה בעת פענוח פאנלים מורחבת של מא ח ו שלהם מטבוליטים בדגימות ביולוגיות מורכבות בעלויות מצטבר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)