Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
前神经入侵是头颈部鳞状细胞癌和其他肿瘤的侵略性表型。小鸡胆膜模型已用于研究血管生成、癌症入侵和转移。在这里,我们演示了如何使用该模型来评估体内的围神经入侵。
神经入侵是癌症包围或侵入神经的表型。它与头颈部鳞状细胞癌和其他癌症的临床效果不佳有关。力学研究表明,神经和肿瘤细胞之间的分子串扰发生在物理相互作用之前。在物理神经-肿瘤相互作用发生之前,只有少数在体内的模型来研究神经外入侵,特别是研究早期进展。小鸡胆膜模型已用于研究癌症入侵,因为胆囊上皮的基底膜模仿了人类上皮组织的膜。在这里,我们重新利用小鸡胆膜模型来研究近神经入侵,将大鼠背根神经结节和人类头颈部鳞状细胞癌细胞移植到胆囊上皮上。我们已经演示了该模型如何可用于评估癌细胞侵入体内神经组织的能力。
前神经入侵(PNI)是癌症中一种研究不足的表型,它与高疾病复发和头部和颈部鳞状细胞癌(HNC)1患者的存活率差有关。PNI在微观上被定义为神经内或周围的肿瘤细胞2,3。当检测到PNI时,患者可能接受辅助疗法,如选择性颈部解剖和/或放射治疗4,5。然而,这些疗法是积极的,而不是PNI特定的。事实上,没有治疗来阻止PNI,主要是因为神经-肿瘤相互作用背后的机制仍然缺乏理解。
不同的分子机制与神经肿瘤的吸引有关;肿瘤和基质细胞释放神经肽和生长因子,促进神经发生6,7。在体外培养时,HNC细胞和背根神经结膜(DRG)都有强大的反应;在6、8、9的培养中几天后,可以看到对肿瘤细胞入侵和神经发生的影响。然而,在入侵之前,缺乏适当的体内模型来重述肿瘤-神经相互作用。在这里,我们提出了一个体内PNI模型,以研究HNC细胞和神经6的早期相互作用。我们调整了小鸡胆膜(CAM)模型,包括神经组分,在CAM中嫁接DRG,然后移植癌细胞来模拟内膜肿瘤微环境。
CAM模型已经成功地用于评估细胞通过基底膜的入侵,模仿癌瘤和黑色素瘤10,11,12的早期侵入性阶段。CAM 由上胆上皮上皮、间痛和下全食上皮组成。胆小节上皮在结构上类似于人类上皮10,13,因为胶原蛋白-IV丰富的基底膜模拟了将口腔上皮与底层结缔组织分离的基底膜。自1913年CAM进行第一次肿瘤移植以来,许多方法的适应被开发,以便评估血管生成15,16,17,肿瘤进展,和转移18.重要的是,将肿瘤移植到CAM上的技术变化很小,但应用在不断发展。报告的复杂性已经公布,包括药物筛选19个,骨组织工程20个,和纳米粒子抗癌药物21个。
我们的实验室使用 CAM-DRG 模型,其中哺乳动物 DRG 被分离并移植到上部 CAM 表面。在DRG被纳入CAM后,HNC细胞在DRG附近移植,并允许在整个体内系统采集和分析之前与DRG相互作用。重要的是,该系统允许通过DRG和肿瘤细胞的荧光标记对DRG和肿瘤进行活体目视观察。该协议包括多个步骤,在17天内执行不同级别的复杂性,从孵化卵子到收获CAM(图1)。表达不同感兴趣的蛋白质的细胞可以在此模型中进行测试,以阐明导致癌症神经入侵的分子通路,以及筛选直接针对神经入侵的药物。用候选药物预处理的细胞可以在CAM上嫁接,与未经治疗的对照组相比,PNI的发生被调查。事实上,CAM模型已经用于药物筛选,作为体外研究和啮齿动物临床前试验之间的中间步骤。
实验设计将随假设而变化。例如,如果测试特定蛋白质在PNI中的作用,实验组将包括移植的DRG与肿瘤细胞过度表达蛋白质,而对照组应包括DRG与细胞稳稳地转染空载体。几个不同的实验设计可用于解决具体问题。
伦理声明:本协议中所有使用大鼠的实验均按照我们机构的IACUC(机构动物护理和使用委员会)规则进行。在这项研究中,对卵子的实验不受IACUC监管。
1. 卵孵育(估计时间:5分钟,零天)
2. 收集并制备DRG(估计时间:2小时,第8天)
注:小鼠和大鼠的实验需要获得(IACUC)的批准。在一些国家,使用鸡蛋也需要批准。
3. 制备用于DRG嫁接的鸡蛋(估计时间:1打鸡蛋1小时,第8天)
4. 在 CAM 上移植 DRG(估计时间:40 分钟,第 8 天)
5. 在 CAM 上移植肿瘤细胞(估计时间:1 小时 30 分钟,第 10 天)
6. 收获CAM(估计时间:1小时打鸡蛋,第17天)
经过优化,该方法在 CAM 中具有接近 100% 的 DRG 集成度。DRG集成的代表性结果如图5A-B所示。 DRG 在 CAM 中的集成非常重要,因为它在实验期间为 DRG 组织提供了可行性。在微观上,DRG在CAM(H&E染色)的结缔组织内可见。血管经常在DRG组织内出现,这表明CAM血液供应正在培育移植的组织。植入的肿瘤也由H&E在CAM上识别;根据入侵的多少,肿瘤可能不存在与无数肿瘤岛屿入侵结缔组织(图5C-D)。代表性图 5E-F显示了在明场成像和合并荧光方面收获的 CAM。UM-SCC-1细胞过度表达Galanin受体2,与对照细胞相比,DRG的入侵增加(图5G-H)。癌症-DRG相互作用被观察为癌细胞呈现对DRG的方向入侵(图5H)。
以不同方式执行数据分析。癌细胞对DRG的定向入侵被观察为二分变量,并且呈现这种入侵模式的卵子数量在每个组中被计算在内。使用比例的二项检验计算组之间的统计差异。使用ImageJ6测量癌细胞和DRG和肿瘤区域之间的接近度,并使用学生不测试评估组之间的差异。为了确保 ImageJ 分析的准确性,同一实验中的所有图像都应在同等的光线和曝光设置下拍摄。使用相同的标准调整所有图像的图像阈值和亮度后,使用分析粒子工具测量肿瘤面积,线性测量工具测量肿瘤-DRG距离。对于不同组的所有图像,使用分析的所有图像的粒子大小的恒定非常重要。在某些情况下,肿瘤变厚,可以用数字卡钳手动测量,从而进行体积测量。
使用石蜡嵌入CAM组织部分,H&E染色或免疫组织化学上皮细胞(抗细胞角蛋白抗体反应对人类物种)可以进行,允许评估结缔组织内的入侵。入侵被量化为每个卵子结缔组织中的肿瘤岛数。胶原蛋白IV的免疫荧光可用于突出基底膜。此外,如果使用带有GFP标记的癌细胞,则无需细胞角蛋白的免疫组织化学,即可在组织部分识别这些细胞。CAM实验中的转移和血管生成分析在10、17别的地方进行了讨论。
图 1:实验时间线,包括第 0、8、10 和 17 天的主要步骤。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:第8天的DRG提取.A.大鼠示意图,说明脊柱的解剖位置.B.显示不同身体区域的鼠椎结构图;绿色表示颈椎,深蓝色表示胸腔,橙色表示腰部,浅蓝色表示骨椎。C-D.手术切除后大鼠脊柱的文心方面;区域的分离,如B所示。E.解剖椎骨以打开脊髓管,将椎体分离成两个侧段,包含DRG.部分应穿过中线每个椎骨的背和腹侧。F.开放胸椎的毛方面.G.脊髓置换后,在椎道中很容易看到 DRG(箭头指向 3 DRG)。H. 带有相应斧头束(箭头)的一个 DRG(箭头)的立体显微图像。刻度条:C、D、F和G,1厘米; H,1毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:第8天准备鸡蛋。A-B.在手术前识别鸡蛋血管和标记。A上的箭头指向自然产生的气囊。C-D.在方形开口标记上钻孔和打开蛋壳。D上的箭头指向在钝钳的帮助下取出壳体后,完整的外壳蛋壳膜。E.气囊上标记的十字架用钻头穿孔,使空气流入鸡蛋(箭头)。30 μL 的 HBSS 介质被放置在方形开口的外壳膜上。F.使用精细注射器针,将外卵壳膜穿孔到HBSS先前放置的位置。G.压力施加在橡胶滴珠灯泡上,同时将其连接到气囊上钻孔的穿孔。当手指压力释放时,空气被真空吸尘,产生一个人工气囊(白色箭头),应延伸到操作窗口。H.操作窗的边缘与蛋壳几乎平行,以避免意外穿孔.I-J.用钝钳去除蛋壳。K.用钝钳去除外蛋壳膜,小心不要在 CAM 上引入颗粒(在表面以下 1 厘米处观察)。L.鸡蛋暂时覆盖石蜡蜡膜,并放回孵化器.请点击此处查看此图的较大版本。
图4:DRG、细胞和CAM的收获:第8天:A。清除石蜡膜后,易于观察 CAM。B-C.使用精细钳子,DRG 被放置在 CAM 上。D.蛋被薄膜敷料覆盖,放入孵化器;箭头指向覆盖的开口。第10天:E-F.薄膜修整被移除,DRG 位于(F 上的箭头)。G-H.5 μL 的电池溶液与 DRG 相距约 2 mm 的距离,滴落到 CAM 上。第 17 天:I-L和M-P演示了用于采集 CAM 的两种不同的方法。I.蛋壳用细剪刀打开,开始在空气囊上钻孔穿孔,直到鸡蛋的上半部分被移除。含有CAM的蛋壳尺寸缩小到约3厘米. K-L.使用精细的钳子,CAM 与蛋壳分离并放置在 PFA 中。M-O.操作窗口的加宽用于可视化 CAM 上的 DRG 和癌细胞。箭头指向肿瘤,箭头指向 DRG。P.CAM 用细钳子抓住,用锋利的剪刀切开,并放置在 PFA 中,如L所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:代表性结果。A. H&E 部分显示 DRG 在 CAM 中的集成。B. A的放大倍率更高;箭头显示 DRG 中的 CAM 血管。C.UM-SCC-1细胞移植到CAM上,在移植四天后收获(H&E染色)。D. C的更高放大倍率,显示CAM结缔组织(箭头)中的侵入性肿瘤岛。E.与UM-SCC-1-GALR2细胞和大鼠DRG嫁接的CAM的毛立体显微镜图像,于第17天采集。F.合并的荧光和亮场图像突出显示以红色标记的 DRG 和标记为绿色的癌细胞。G-H.CAM的荧光立体显微镜与DRG和UM-SCC-1-GALR2对对照细胞进行移植,说明UM-SCC-1-GALR2细胞对DRG(H)的定向入侵。刻度条:A-D,500 μm;E-H,2 毫米.请点击这里查看此图的较大版本.
步 | 问题 | 原因 | 解决 方案 | ||||||
3.2.1 | 无法识别胚胎附件。 | 当鸡蛋静止时,附件位置很难看到。 | 快速侧向旋转卵子,以便看到附着在蛋膜上的长容器。 | ||||||
3.3 和 3.8 | 钻孔时对外蛋壳膜的穿孔。 | 钻头定位错误。 | 钻孔时,将钻头与蛋壳几乎平行放置。如果膜在步骤3.3中穿孔,则无需按照步骤3.5所述用针进行进一步穿孔。如果发生出血,丢弃卵子。 | ||||||
4.3 | DRG 粘在钳子上。 | DRG 干燥。 | 在 HBSS 中再次使用湿 DRG 和/或使用细针帮助从钳子中分离 DRG。 | ||||||
5.2 | 细胞没有完全标记荧光染料。 | 孵育时间。某些单元格需要更多时间进行标记。 | 用荧光染料将细胞在介质中多保存一小时。 | ||||||
5.6 | 细胞上的气泡掉落。 | 使用移液器尖端中的所有液体。 | 负载超过所需体积1μL,在植入细胞时不要使用移液器的最终μL。这将避免细胞混合中的气泡。 | ||||||
6.3 | 收获 CAM 时无法识别 DRG 或细胞。 | 小DRG,DRG被取代,癌细胞扩散。 | 如果未看到 DRG,则收获 CAM 的较大区域,并放入更大的容器进行固定。在立体显微镜中检查荧光下的DRG和细胞位置,然后将CAM修剪为更小的石蜡嵌入尺寸。 |
表 1:疑难解答表
这里介绍的CAM-DRG体内模型通过在肿瘤细胞物理侵入神经之前演示神经-肿瘤相互作用,解决了以前模型的缺陷。大多数PNI体内研究侧重于肿瘤扩散和抑制运动功能,并依靠肿瘤细胞直接注射到坐骨神经23,24,25。坐骨神经注射是PNI的体内模型,癌细胞被注射到小鼠或大鼠坐骨神经中,肿瘤随后生长。注射模型可用于显示神经内肿瘤细胞引起的破坏性肿瘤进展和疼痛。坐骨神经模型也适合研究允许癌细胞在神经中茁壮成长,但缺乏评估PNI早期的能力,因为它将细胞直接引入神经,绕过神经护套。在不同的方法中,手术植入的正交肿瘤移植物用于描述肾上腺素和胆碱能神经纤维在促进前列腺癌进展中的重要性,从而表明神经在肿瘤进展中的突出作用26.这种模式包括化学消融的鼠感和寄生神经的化学消融。寄生纤维渗入肿瘤组织,这是一个与PNI相关的过程,但该模型没有专门用于评估神经和肿瘤之间的物理相互作用。CAM-DRG模型允许研究PNI期间神经和癌症之间的相互作用。此外,与 CAM 型号相比,鼠模型既昂贵又耗时。建议利用CAM-DRG模型对PNI进行力学研究。
CAM-DRG 方法的一些优点包括评估 PNI 和其他表型,如肿瘤生长、转移和血管生成。在较低的CAM和/或肝脏上鉴定人类DNA可用于检测人类癌细胞系10的转移,这是一种比组织切片和染色更敏感的实验方法,这可能不会揭示小转移。
CAM-DRG方法存在一定的局限性,包括观测时间框架短。胚胎的免疫系统在第1827天生理上活跃,届时可能会出现排斥和炎症过程,从而限制了实验时间。在移植接近DRG的肿瘤细胞时,考虑距离也很重要;较大的DRG-癌症距离可能会损害肿瘤细胞和神经之间的分子相互作用,或者可能延迟模型两个组分之间的物理接触。此外,如果胚胎的年长超过本协议的规定,胚胎运动可能会取代肿瘤细胞。因此,使用与受精后第10天一致的卵子进行细胞移植是很重要的。
由于免疫系统在1827日之前尚未完全发育,CAM中的肿瘤微环境与通常用于癌症研究的免疫抑制鼠模型相似。因此,该模型对评估免疫细胞在肿瘤进展中的作用没有用处。另一个限制是鸡种试剂的供应受限,如抗体、细胞因子和引物。
准确执行此协议需要实践;然而,它可以通过实验室成员完成,而无需专门的核心设施。钻蛋壳需要训练。建议在首次尝试此模型之前,先在杂货(非受精)鸡蛋上练习。如果遵循一些避免感染的关键步骤,可以实现高胚胎存活率和模型的成功:在2%Pen/Strep中适当预防DRG,在层流柜中工作,避免蛋壳颗粒分散到 CAM 上。在卵子孵育期间保持稳定的湿度也是至关重要的。我们建议增加每组鸡蛋的数量,直到掌握该技术。对于缺乏经验的实验室人员来说,最常见的问题是卵子污染和细胞移植技术不准确。
DRG收获也需要培训;建议在尝试体内模型之前,先在体外实验中收获DRG。体外DRG培养是优化条件、改进技术以缩短DRG提取持续时间的机会。用钳子抓住DRG时,需要特别注意收获技术。DRG 不应直接举行;压力应施加在压力下方。我们建议使用放大镜在提取过程中更好地可视化 DRG。
重要的是,当首次执行此模型时,所有条件都应针对所需的细胞系进行优化。该模型针对大鼠DRG和HNC细胞系UM-SCC-1进行了优化。使用小鼠DRG和其他癌细胞类型可能需要优化。随着移植细胞浓度越高,肿瘤往往变厚变硬,从而有利于肿瘤的测量。考虑到每个组有多个卵子和每个卵子的细胞适当浓度,每个实验可能需要几百万个细胞。为了便于规划,应考虑对细胞翻倍时间的了解。对于此协议中的一些关键步骤,提供了故障排除表 (表1)。
作者声明没有相互竞争的利益。
这项工作得到了NIH/NIDCR授予DE027551和DE022567(NJD)的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
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