Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
Perineural invasie is een agressief fenotype voorhoofd-en nek plaveiselcel cel carcinoom en andere tumoren. Het kuiken chorioallantoic membraan model is gebruikt voor het bestuderen van bloedvat, kanker invasie, en metastase. Hier laten we zien hoe dit model kan worden gebruikt om perineural invasie in vivo te beoordelen.
Perineural invasie is een fenotype waarin kanker omringt of de zenuwen binnendringt. Het wordt geassocieerd met een slechte klinische uitkomst voorhoofd-en nek plaveiselcel cel carcinoom en andere kankers. Mechanistische studies hebben aangetoond dat de moleculaire Overspraak tussen zenuwen en tumorcellen optreedt voorafgaand aan de fysieke interactie. Er zijn slechts een paar in vivo modellen om perineural invasie te bestuderen, vooral om vroege progressie te onderzoeken, voordat fysieke zenuw-tumor interacties optreden. De Chick chorioallantoic membraan model is gebruikt om kanker invasie studie, omdat de kelder membraan van de chorion epitheel bootst dat van de menselijke epitheelweefsel. Hier hebben we hergebruikt het kuiken chorioallantoic membraan model te onderzoeken perineural invasie, enten rat dorsale wortel ganglia en menselijke hoofd en nek plaveiselcel cel carcinoom cellen op de chorion epitheel. We hebben aangetoond hoe dit model kan nuttig zijn om het vermogen van kankercellen te evalueren om neurale weefsel binnen te vallen in vivo.
Perineural Invasion (PNI) is een onderstudeerde fenotype in kanker, die wordt geassocieerd met een hoge ziekte herhaling en slechte overleving bij patiënten met hoofd en nek plaveiselcel cel carcinoom (HNC)1. PNI wordt microscopisch bepaald als tumorcellen binnen of het omringen van zenuwen2,3. Wanneer PNI wordt gedetecteerd, patiënten zijn waarschijnlijk adjuvante therapieën, zoals electieve nek dissectie en/of bestraling4,5te ontvangen. Echter, deze therapieën zijn agressief, en niet PNI-specifiek. In feite is er geen therapie om PNI te blokkeren, vooral omdat de mechanismen ten grondslag liggen aan zenuw-tumor interacties zijn nog steeds slecht begrepen.
Verschillende moleculaire mechanismen zijn betrokken bij de zenuw-tumor aantrekkingskracht; tumoren en stromale cellen release peptiden en groeifactoren ter bevordering van neuritogenesis6,7. Wanneer gecultiveerd samen in vitro, HNC cellen en dorsale wortel ganglia (DRG) allebei hebben een robuuste reactie; effecten op de tumor cel invasie en neuritogenesis kan worden gezien na een paar dagen in cultuur6,8,9. Er is echter een gebrek aan geschikte in vivo modellen om recapituleren tumor-zenuw interacties voorafgaand aan de invasie. Hier presenteren we een in vivo PNI model om vroege interacties te bestuderen tussen HNC cellen en zenuwen6. We aangepast de Chick chorioallantoic membraan (CAM) model op te nemen een neurale component, enten een DRG in de nok, gevolgd door een Graft van kankercellen om een geïnnerveerd tumor microomgeving na te bootsen.
De CAM model is met succes gebruikt om de invasie van cellen te beoordelen door middel van de kelder membraan, het nabootsen van vroege invasieve stadia van carcinoom en melanoom10,11,12. De nok bestaat uit de bovenste chorion epitheel, tussenliggende mesenchym, en lagere allantoïs epitheel. Het chorion epitheel is structureel vergelijkbaar met menselijk epitheel10,13 in dat de collageen-IV-rijke kelder membraan simuleert de kelder membraan dat het orale epitheel scheidt van de onderliggende bindweefsel. Sinds de eerste tumor enten werden uitgevoerd in de cam in 191314, vele aanpassingen van de methode werden ontwikkeld om voor de beoordeling van bloedvat15,16,17, tumor progressie, en metastase18. Belangrijk is dat de techniek van het enten tumoren op de CAM is zeer weinig veranderd, maar de toepassingen zijn voortdurend in ontwikkeling. Analyses van toenemende complexiteit zijn gepubliceerd, met inbegrip van drug screening19, Bone tissue engineering20, en nanopartikels gebaseerde geneesmiddelen tegen kanker21.
Ons laboratorium maakt gebruik van een CAM-DRG model waarin een zoogdier DRG is geïsoleerd en geënt op het oppervlak van de bovenste NOK. Nadat DRG in de nok wordt opgenomen, worden de HNC cellen geënte dichtbij DRG en toegestaan om met DRG in wisselwerking te staan alvorens het volledige in vivo systeem wordt geoogst en geanalyseerd. Belangrijk, laat het systeem ex-vivo visuele observatie van zowel DRG als de tumor door fluorescentie etikettering van DRG en tumorcellen toe. Dit protocol bestaat uit meerdere stappen met verschillende niveaus van complexiteit uitgevoerd binnen 17 dagen, van broedeieren tot het oogsten van de nok (Figuur 1). De cellen die verschillende proteïnen van belang uiten kunnen in dit model worden getest om de moleculaire wegen te verhelderen verantwoordelijk voor zenuw invasie in kanker, en ook voor het onderzoeken van drugs om neurale invasie direct te richten. Cellen vooraf behandeld met een kandidaat-geneesmiddel kan worden geënt op de nok en het optreden van PNI onderzocht in vergelijking met onbehandelde controles. In feite, is het NOKKEN model gebruikt voor drugonderzoek als tussenstap tussen in vitro studies en pre-klinisch in vivo proeven in knaagdieren19.
Het experimentele ontwerp zal variëren met de hypothese. Bijvoorbeeld, als het testen van de rol van een specifiek eiwit op PNI, zou de experimentele groep DRG geënt met tumorcellen omvatten die de proteïne overdrukken, terwijl de controlegroep DRG met cellen zou moeten omvatten stabiel transfected met lege Vector. Verschillende experimentele ontwerpen kunnen worden gebruikt om specifieke vragen te beantwoorden.
Ethiek statement: alle experimenten met behulp van ratten in dit protocol worden gedaan in overeenstemming met DEC (Institutional Animal Care en use Comite) regels van onze instelling. Experimenten met eieren in deze studie zijn vrijgesteld van DEC regelgeving.
1. incubatie van het ei (geschatte timing: 5 min, dag nul)
2. oogst en bereiding van DRGs (geschatte timing: 2 h, dag 8)
Opmerking: experimenten met muizen en ratten vereisen goedkeuring van de (DEC). In sommige landen, het gebruik van kippeneieren vereist ook goedkeuring.
3. bereiding van de eieren voor DRG enten (geschatte timing: 1 uur voor een dozijn eieren, dag 8)
4. enten DRG op de nok (geschatte timing: 40 min, dag 8)
5. enten tumorcellen op de nok (geschatte timing: 1 h 30 min, dag 10)
6. het oogsten van de nok (geschatte timing: 1 h voor dozijn eieren, dag 17)
Wanneer geoptimaliseerd, heeft deze methode dichtbij 100% DRG integratie in de nok. De representatieve resultaten van DRG integratie worden getoond in figuur 5a-B. De integratie van DRG in de nok is belangrijk aangezien het levensvatbaarheid aan het DRG weefsel tijdens het experiment verstrekt. Microscopisch, wordt DRG gezien binnen het verbindingsweefsel van de nok (H & E vlek). Bloedvaten worden vaak gezien in de DRG weefsel, wat suggereert dat de CAM bloedtoevoer is het voeden van de geënte weefsel. Geïmplanteerde tumoren worden ook geïdentificeerd op de nok door H & E; afhankelijk van hoeveel invasie aanwezig is, tumoren kunnen aanwezig zijn met geen enkele tot tal van tumor eilanden invasie van het bindweefsel (figuur 5c-D). De representatieve figuur 5e-F toont de geoogste nok op helderveld Imaging en samengevoegd fluorescentie. UM-SCC-1 de cellen die Goeman receptor 2 overexpressen presenteerden verhoogde invasie van DRG in vergelijking met controlecellen (cijfer 5g-H). Kanker-DRG de interactie wordt waargenomen als kankercellen die richtings invasie naar DRG voorstellen (cijfer 5H).
Data-analyse wordt uitgevoerd op verschillende manieren. De directionele invasie van kankercellen in de richting van de DRG wordt waargenomen als een dichotome variabele en het aantal eieren presenteren dit patroon van de invasie wordt geteld in elke groep. Statistische verschillen tussen groepen worden berekend met behulp van een binomiale test van de verhoudingen. De nabijheid tussen kankercellen en DRG, en tumorgebied worden gemeten gebruikend ImageJ6 en de verschillen tussen groepen worden beoordeeld gebruikend de test van de student t. Om de nauwkeurigheid te verzekeren met ImageJ analyse, moeten alle beelden van hetzelfde experiment worden genomen op gelijke licht en belichting instellingen. Na het aanpassen van de beeld drempel en de helderheid van alle beelden met dezelfde criteria, de Analyseer deeltjes tool wordt gebruikt om tumorgebied te meten en de lineaire meetinstrument maatregelen tumor-DRG afstanden. Het is belangrijk om constante opstelling van grootte van deeltjes te gebruiken die voor alle beelden over verschillende groepen worden geanalyseerd. In sommige gevallen, tumoren groeien dikker en kan handmatig worden gemeten met een digitale remklauw, waardoor een volumemeting.
Met behulp van delen van paraffine-embedded CAM weefsel, H & E vlek of Immunohistochemistry voor epitheelcellen (anti-cytokeratine antilichaam reactief voor menselijke soort) kan worden uitgevoerd, waardoor de beoordeling van de invasie binnen het bindweefsel. Invasie wordt gekwantificeerd als het aantal tumor eilanden in het bindweefsel per ei. Immunofluorescentie voor collageen IV kan worden gebruikt om de kelder membraan te markeren. Ook, als het gebruiken van GFP-geëtiketteerde kankercellen, wordt de identificatie van deze cellen in de weefselsecties vergemakkelijkt zonder een Immunohistochemistry voor cytokeratine. Metastase en bloedvat analyse in cam experimenten worden elders besproken10,17.
Figuur 1: experiment tijdlijn met inbegrip van de belangrijkste stappen op dagen 0, 8, 10 en 17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: DRG extractie op dag 8 . A. rat Schematische illustratie van de anatomische locatie van de wervelkolom. B. diagram van de rat wervels configuratie die verschillende lichaamsgebieden toont; groen voor cervicale, donkerblauw voor thoracale, sinaasappel voor lumbale en licht blauw voor sacrale wervels. C-D. Buik aspect van de rat wervelkolom na chirurgische besnijdenis; scheiding van de regio's zoals geïllustreerd in B. E. dissectie van de wervels om het Ruggenmergkanaal te openen, het scheiden van de wervellichamen in twee laterale secties met de DRGs. sectie moet snijden door de dorsale en buik aspect van elk wervel been op de middellijn. F. bruto aspect van geopende thoracale wervelkolom. G. nadat het ruggenmerg is verplaatst, DRGs zijn gemakkelijk zichtbaar in de wervel kanalen (pijltjes hoofden wijzend 3 DRGs). H. Stereomicroscopic beeld van één DRG (pijl) met de overeenkomstige axon bundels (het hoofd van de pijl). Schaal staven: C, D, F, en G, 1 cm; H, 1 mm. gelieve te klikken hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bereiding van de eieren op dag 8. A-B. Identificatie van ei-vasculatuur en markeringen voorafgaand aan de procedure. Pijlen op een punt om de natuurlijk voorkomende lucht SAC. C-D. Boren en openen van de eierschaal op het vierkante openings merk. Pijl op D wijst naar de intacte buitenste ei shell membraan na het verwijderen van de schelp met de hulp van botte Tang. E. het gemarkeerde kruis op de Air SAC is geperforeerd met de boor om de luchtstroom in het ei (pijl hoofd). 30 µ L van Peeters medium wordt geplaatst op de buitenste ei shell membraan op het plein opening. F. met een fijne spuit naald, is het buitenste ei shell membraan geperforeerd waar de Peeters eerder werd geplaatst. G. de druk wordt toegepast op een rubberen pipet bol terwijl het bevestigen aan de perforatie die op de luchtzak wordt geboord. Wanneer de vingerdruk wordt vrijgegeven, wordt de lucht gestofzuigd, die een kunstmatige lucht zak (witte pijlen) produceert die zich aan het werkende venster zou moeten uitstrekken. H. de randen van het werkende venster worden geboord in een bijna parallelle positie aan de eierschaal, om toevallige perforatie te vermijden. I-J. Verwijdering van de eierschaal met botte Tang. K. Verwijder de buitenste eierschaal membraan met stompe Tang, die voorzichtig zijn om geen deeltjes te introduceren op de nok (waargenomen op ̴1 cm onder het oppervlak). L. eieren zijn tijdelijk bedekt met een paraffine membraan en zet terug in de incubator. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: enten van DRG, cellen, en oogsten van de nok: op dag 8: A. CAM gemakkelijk waargenomen na paraffine membraan verwijderen. B-C. Met fijne Tang, wordt DRG geplaatst op de nok. D. ei is bedekt met film dressing en zet in de incubator; pijlen wijzen op de openingen die worden gedekt. Op dag 10: E-F. Film dressing is verwijderd en DRG is gelegen (pijl hoofd op F). G-H. 5 µ L van cel oplossing is gedaald op de nok op een ~ 2 mm afstand van de DRG. Op dag 17: I-L en M-P demonstreren twee verschillende benaderingen die worden gebruikt om de nok te oogsten. I. Egg shell wordt geopend met een fijne schaar te beginnen op de Air SAC geperforeerde perforatie tot de bovenste helft van het ei wordt verwijderd. J. eierschaal met de nok wordt in grootte verlaagd tot ongeveer 3 cm. K-L. Met fijne Tang, is CAM losgemaakt van de eierschaal en geplaatst in de geplaatste. M-O. Het verwijden van het werkende venster wordt uitgevoerd om de DRG en kankercellen op de nok te visualiseren. Pijlpunt wijst op de tumor en de pijl wijst naar de DRG. P. de nok is gevat met fijne Tang, uitgesneden met een scherpe schaar, en geplaatst in de werkplaats zoals aangegeven in L. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve resultaten. A. H &Amp; E sectie die integratie van DRG in de nok toont. B. hogere vergroting van A; pijlen tonen CAM bloedvaten in de DRG. C. um-SCC-1 cellen geënt op de nok en geoogst vier dagen na het enten (H & E vlek). D. hogere vergroting van C die invasieve tumor eilanden in het nokken verbindingsweefsel (pijlen) toont. E. bruto stereomicroscopic beeld van de cam geënt met um-SCC-1-GALR2 cellen en rat DRG, geoogst op dag 17. F. samengevoegd fluorescentie en helderveld beelden die de DRG benadrukken die in rood en kankercellen wordt geëtiketteerd die in groen worden geëtiketteerd. G-H. Fluorescentie stereomicroscopy van de nok die met DRG wordt geënt en UM-SCC-1-GALR2 versus controlecellen, die richtings invasie van UM-SCC-1-GALR2 cellen aan DRG (H) illustreren. Schaal staven: A-D, 500 µm; E-H, 2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Stap | Probleem | Reden | Oplossing | ||||||
3.2.1 | Kan de embryo bijlage niet identificeren. | Attachment positie is moeilijk te zien, terwijl ei is nog steeds. | Draai het ei snel zijwaarts te kunnen om een lang schip bevestigd aan het ei membraan te zien. | ||||||
3,3 & 3,8 | Perforatie van de buitenste eierschaal membraan tijdens het boren. | Verkeerde positionering van de boor. | Plaats de boor bijna parallel aan de eierschaal tijdens het boren. Als membraan is geperforeerd in stap 3,3, is er geen noodzaak om verdere perforatie met naald uit te voeren, zoals vermeld in stap 3,5. Als bloeden gebeurt, gooi het ei. | ||||||
4,3 | DRG stokken aan de Tang. | DRG is droog. | Natte DRG opnieuw in Peeters en/of gebruik een fijne naald om DRG van pincet te helpen losmaken. | ||||||
5,2 | Cellen zijn niet perfect gelabeld met fluorescerende kleurstof. | Incubatietijd. Sommige cellen vereisen meer tijd om te labelen. | Houd cellen voor een extra uur in de media met fluorescerende kleurstof. | ||||||
5,6 | Lucht zeepbel op de cel neerzetten. | Met behulp van alle vloeistof in de pipet tip. | Laad 1 µ L meer dan het gewenste volume en gebruik de laatste µ L van de pipet niet bij het implanteren van cellen. Dit voorkomt luchtbellen in de cellen mix. | ||||||
6,3 | Niet in staat om DRG of cellen te identificeren bij het oogsten van de CAM. | Kleine DRG, DRG werd verplaatst, kankercellen uitgespreid. | Als DRG niet wordt gezien, oogst een groter gebied van de nok en plaats in een grotere container voor bevestiging. Controleer DRG en cel positie onder fluorescentie in een stereomicroscoop, en dan trim de nok aan een kleiner formaat voor paraffine inbedding. |
Tabel 1: problemen met tabel oplossen
De CAM-DRG in vivo model hier gepresenteerd adressen van de tekorten van de vorige modellen door te demonstreren zenuw-tumor interactie voor fysieke invasie van de zenuw door tumorcellen. De meeste in vivo studies van PNI focus op tumor verspreiding en remming van de motorische functie, en afhankelijk van directe injectie van tumorcellen in de heup zenuwen23,24,25. De heupzenuw injectie is een in vivo model van PNI waar kankercellen worden geïnjecteerd in een muis of rat heupzenuw waar de tumor vervolgens groeit. Injectie modellen zijn nuttig om destructieve progressie van de tumor en pijn als gevolg van tumorcellen in de zenuwen te tonen. De heupzenuw model is ook geschikt voor de studie van factoren die het mogelijk maken kankercellen te gedijen in de zenuw, maar mist de mogelijkheid om de vroege fase van PNI te evalueren, omdat het introduceert cellen direct in de zenuw, het omzeilen van zenuw scheden. In een andere benadering, chirurgisch geïmplanteerde orthotopic tumor enten werden gebruikt om het belang van adrenerge en cholinerge zenuwvezels te karakteriseren bij het bevorderen van prostaatkanker progressie, dus suggereert een prominente rol van zenuwen in tumor progressie 26. dit model bestond uit chemische ablatie van muizen sympathieke en parasympathische zenuwen. De parasympathische vezels geïnfiltreerd tumor weefsels, een proces met betrekking tot PNI, maar het model werd niet specifiek gebruikt om de fysieke interacties tussen de zenuw en tumor te beoordelen. De CAM-DRG model maakt onderzoek van de interacties tussen de zenuw en kanker tijdens PNI. Bovendien, muizenmodellen zijn duur en tijdrovend in vergelijking met de CAM-model. We raden het gebruik van de CAM-DRG model voor mechanistische studies van PNI.
Sommige voordelen aan de nok-DRG benadering omvatten beoordeling van PNI en andere fenotypes, zoals tumorgroei, metastase, en bloedvat. Identificatie van menselijk DNA op de lagere nok en/of in de lever kan worden gebruikt voor de opsporing van metastase van menselijke kanker cel lijnen10, een meer gevoelige experimentele aanpak ten opzichte van weefsel doorsnede en kleuring, die niet kunnen onthullen kleine uitzaaiingen.
De CAM-DRG methode heeft een aantal beperkingen, met inbegrip van de korte observatietijd frame. Het immuunsysteem van het embryo is fysiologisch actief op dag 1827, wanneer afwijzing en een inflammatoire proces kan plaatsvinden, het beperken van de experimentele tijd. Het is ook belangrijk om de afstand te overwegen wanneer het enten van tumorcellen dicht bij DRG; de grotere DRG-kanker afstanden zouden de moleculaire interactie tussen tumorcellen en zenuw kunnen schaden, of konden het fysieke contact tussen beide componenten van het model vertragen. Ook als de embryo's ouder zijn dan bepaald in dit protocol, kunnen embryo bewegingen de tumorcellen verleggen. Daarom is het belangrijk om eieren te gebruiken in overeenstemming met dag 10 post-fertilisatie voor cel enten.
Aangezien het immuunsysteem is niet volledig ontwikkeld voor dag 1827, de tumor microenvironment in de nok is vergelijkbaar met die van de immuungecompromitteerde muizenmodellen vaak gebruikt voor kanker studies. Daarom is dit model niet nuttig om de rol van immune cellen in tumorvooruitgang te beoordelen. Een andere beperking is de beperkte beschikbaarheid van reagentia voor kippen soorten, zoals antilichamen, cytokines en primers.
Het correct uitvoeren van dit protocol vereist praktijk; Nochtans, kan het door een laboratorium lid zonder behoefte aan een gespecialiseerde kernfaciliteit worden gedaan. Het boren van het ei shell vereist opleiding. Oefenen op kruidenier (niet-bevrucht) eieren wordt aanbevolen voordat u probeert dit model voor de eerste keer. De hoge embryonale overleving en het succes van het model kunnen worden bereikt als sommige kritieke stappen om besmetting te vermijden worden gevolgd: aangewezen antibiotische profylaxe van DRGs in 2% pen/keelontsteking, het werken in een laminaire stroom kabinet, en het vermijden van verspreiding van de deeltjes van de eierschaal op de CAM. Het is ook van cruciaal belang om stabiele vochtigheid te houden tijdens de totale eicel incubatietijd. Wij raden aan om het aantal eieren per groep te verhogen tot de techniek onder de knie is. De meest voorkomende problemen voor onervaren laboratorium personeel zijn eicel contaminatie en onnauwkeurige techniek voor het enten van cellen.
DRG het oogsten vereist ook opleiding; praktijk in het oogsten van DRGs voor in vitro experimenten8 alvorens het in vivo model te proberen wordt aanbevolen. De in vitro DRG cultuur is een kans om voorwaarden te optimaliseren en techniek te verbeteren om de duur van DRG extractie te verkorten. Speciale aandacht voor de oogst techniek is vereist bij het grijpen van de DRG met een tang. DRG zou niet direct moeten worden gehouden; de druk moet eronder worden aangebracht. Wij raden het gebruik van Vergrootglas om beter te visualiseren de DRG tijdens de extractie.
Belangrijk, bij het uitvoeren van dit model voor de eerste keer, moeten alle voorwaarden worden geoptimaliseerd voor de gewenste cel lijn. Dit model is geoptimaliseerd voor rat DRG en de HNC Cell line UM-SCC-1. Het gebruik van muis DRG en andere soorten kankercellen kan vereisen optimalisatie. Met een hogere concentratie van geënte cellen, tumoren hebben de neiging om te groeien dikker en stijver, die tumor metingen vergemakkelijkt. Rekening houdend met meerdere eieren voor elke groep en een passende concentratie van cellen voor elk ei, kan een aantal miljoen cellen nodig zijn voor elk experiment. Om de planning te vergemakkelijken, moet kennis van de verdubbelingstijd van de cellen in aanmerking worden genomen. Voor sommige kritieke stappen in dit protocol wordt een tabel voor probleemoplossing geleverd (tabel 1).
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dit werk werd ondersteund door NIH/NIDCR Grants DE027551 en DE022567 (NJD).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved