Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
Perineurale Invasion ist ein aggressiver Phänotyp für Kopf- und Halsplattenkarzinome und andere Tumoren. Das Küken-Chorioallanto-Membranmodell wurde zur Untersuchung von Angiogenese, Krebsinvasion und Metastasierung verwendet. Hier zeigen wir, wie dieses Modell genutzt werden kann, um die perineurale Invasion in vivo zu bewerten.
Perineurale Invasion ist ein Phänotyp, bei dem Krebs die Nerven umgibt oder eindringt. Es ist verbunden mit schlechten klinischen Ergebnissen für Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom und andere Krebsarten. Mechanistische Studien haben gezeigt, dass das molekulare Übersprechen zwischen Nerven und Tumorzellen vor der physikalischen Interaktion auftritt. Es gibt nur wenige In-vivo-Modelle, um die perineurale Invasion zu untersuchen, insbesondere um die frühe Progression zu untersuchen, bevor physikalische Nerven-Tumor-Wechselwirkungen auftreten. Das Küken-Chorioallanto-Membranmodell wurde verwendet, um die Krebsinvasion zu untersuchen, da die Kellermembran des Chorionepithels die des menschlichen Epithelgewebes imitiert. Hier haben wir das Küken-Chorioallanto-Membranmodell umfunktioniert, um die perineurale Invasion zu untersuchen, die Dorsalwurzelganglien der Rate und die Plattenepithelkarzinomzellen des menschlichen Kopfes und Deshalses auf das Chorionepithel zu pfropfen. Wir haben gezeigt, wie dieses Modell nützlich sein kann, um die Fähigkeit von Krebszellen zu bewerten, in vivo in neuronales Gewebe einzudringen.
Perineurale Invasion (PNI) ist ein unteruntersuchter Phänotyp bei Krebs, der mit einem hohen Krankheitsrezidiv und einem schlechten Überleben bei Patienten mit Kopf- und Halsplattenzellkarzinom (HNC)1assoziiert ist. PNI ist mikroskopisch als Tumorzellen innerhalb oder um die Nervendefiniert 2,3. Wenn PNI nachgewiesen wird, erhalten Patienten wahrscheinlich adjuvante Therapien wie elektive Nackensektion und/oder Strahlentherapie4,5. Diese Therapien sind jedoch aggressiv und nicht PNI-spezifisch. Tatsächlich gibt es keine Therapie, um PNI zu blockieren, vor allem, weil die Mechanismen, die Nerven-Tumor-Wechselwirkungen zugrunde liegen, immer noch schlecht verstanden werden.
Verschiedene molekulare Mechanismen wurden in die Anziehung von Nerventumoren involviert; Tumoren und Stromalzellen setzen Neuropeptide und Wachstumsfaktoren frei, um die Neuritogenese zu fördern6,7. Wenn sie in vitro kultiviert werden, haben HNC-Zellen und dorsale Wurzelganglien (DRG) beide eine robuste Reaktion; Auswirkungen auf Tumorzellinvasion und Neuritogenese können nach ein paar Tagen in Kultur6,8,9gesehen werden. Es fehlt jedoch an geeigneten In-vivo-Modellen, um Tumor-Nerven-Wechselwirkungen vor der Invasion zu rekapitulieren. Hier stellen wir ein in vivo PNI-Modell vor, um frühe Wechselwirkungen zwischen HNC-Zellen und Nerven zu untersuchen6. Wir passten das Küken-Chorioallanto-Membran-Modell (CAM) an, um eine neuronale Komponente einzuschließen, indem wir ein DRG in das CAM transplantierten, gefolgt von einem Transplantat von Krebszellen, um eine innervierte Tumormikroumgebung nachzuahmen.
Das CAM-Modell wurde erfolgreich verwendet, um die Invasion von Zellen durch die Kellermembran zu bewerten, nachahmt frühe invasive Stadien von Karzinomen und Melanom10,11,12. Das CAM besteht aus dem oberen Chorionepithel, dem dazwischen liegenden Mesenchym und dem unteren allantoischen Epithel. Das Chorionepithel ist dem menschlichen Epithel10,13 strukturell ähnlich, da die kollagen-IV-reiche Kellermembran die Kellermembran simuliert, die das mundliche Epithel vom darunter liegenden Bindegewebe trennt. Da die ersten Tumortransplantate 191314im CAM durchgeführt wurden, wurden viele Anpassungen der Methode entwickelt, um die Beurteilung der Angiogenese15,16,17, Tumorprogression und Metastasen18. Wichtig ist, dass sich die Technik der Transplantation von Tumoren auf das CAM kaum verändert hat, aber die Anwendungen entwickeln sich ständig weiter. Es wurden Assays mit zunehmender Komplexität veröffentlicht, darunter das Arzneimittelscreening19, Knochengewebe-Engineering20und Nanopartikel-basierte Krebsmedikamente21.
Unser Labor verwendet ein CAM-DRG-Modell, bei dem ein Säugetier-DRG isoliert und auf die Oberfläche des oberen CAM gepfropft wird. Nachdem das DRG in das CAM integriert wurde, werden HNC-Zellen in der Nähe des DRG transplantiert und dürfen mit dem DRG interagieren, bevor das gesamte In-vivo-System geerntet und analysiert wird. Wichtig ist, dass das System eine ex-vivo visuelle Beobachtung sowohl des DRG als auch des Tumors durch Fluoreszenzkennzeichnung von DRG- und Tumorzellen ermöglicht. Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte mit unterschiedlicher Komplexität, die innerhalb von 17 Tagen durchgeführt werden, von der Brut von Eiern bis zur Ernte des CAM (Abbildung 1). Zellen, die verschiedene Proteine von Interesse exemittieren, können in diesem Modell getestet werden, um die molekularen Pfade aufzuklären, die für die Nerveninvasion bei Krebs verantwortlich sind, und auch für das Screening von Medikamenten, um die neuronale Invasion direkt ins Visier zu nehmen. Zellen, die mit einem Kandidatenmedikament vorbehandelt wurden, können auf das CAM transplantiert und das Auftreten von PNI im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen untersucht werden. Tatsächlich wurde das CAM-Modell für das Arzneimittelscreening als Zwischenschritt zwischen In-vitro-Studien und präklinischen In-vivo-Studien an Nagetieren19verwendet.
Das experimentelle Design wird mit der Hypothese variieren. Wenn beispielsweise die Rolle eines bestimmten Proteins auf PNI getestet wird, würde die experimentelle Gruppe DRG umfassen, die mit Tumorzellen transplantiert wird, die das Protein überexzitieren, während die Kontrollgruppe DRG mit Zellen umfassen sollte, die stabil mit leerem Vektor transfiziert sind. Verschiedene experimentelle Entwürfe können verwendet werden, um spezifische Fragen zu beantworten.
Ethik-Erklärung: Alle Experimente mit Ratten in diesem Protokoll werden in Übereinstimmung mit den IACUC-Regeln (Institutional Animal Care and Use Committee) unserer Institution durchgeführt. Versuche mit Eiern in dieser Studie sind von der IACUC-Verordnung ausgenommen.
1. Ei-Inkubation (geschätztes Timing: 5 min, Tag Null)
2. Ernte und Vorbereitung von DRGs (geschätzter Zeitpunkt: 2 h, Tag 8)
HINWEIS: Experimente mit Mäusen und Ratten bedürfen der Genehmigung durch die (IACUC). In einigen Ländern bedarf die Verwendung von Hühnereiern ebenfalls der Genehmigung.
3. Vorbereitung von Eiern für die DRG-Veredelung (geschätzter Zeitpunkt: 1 h für ein Dutzend Eier, Tag 8)
4. Grafting DRG auf dem CAM (geschätzter Zeitpunkt: 40 min, Tag 8)
5. Transplantation tumorzellen auf dem CAM (geschätztes Timing: 1 h 30 min, Tag 10)
6. Ernte des CAM (geschätzter Zeitpunkt: 1 h für Dutzend Eier, Tag 17)
Wenn diese Methode optimiert ist, verfügt sie über eine nahezu 100%ige DRG-Integration im CAM. Repräsentative Ergebnisse der DRG-Integration sind in Abbildung 5A-Bdargestellt. Die Integration von DRG in das CAM ist wichtig, da es dem DRG-Gewebe während des Experiments lebenserhaltend ist. Mikroskopisch wird die DRG im Bindegewebe des CAM (H&E-Färbung) gesehen. Blutgefäße sind oft im DRG-Gewebe zu sehen, was darauf hindeutet, dass die CAM-Blutversorgung das transplantierte Gewebe nährt. Implantierte Tumoren werden auch auf dem CAM von H&E identifiziert; Je nachdem, wie viel Invasion vorhanden ist, können Tumore mit keiner bis zu zahlreichen Tumorinseln vorhanden sein, die in das Bindegewebe eindringen (Abbildung 5C-D). Die repräsentative Abbildung 5E-F zeigt das geerntete CAM auf Hellfeld-Bildgebung und zusammengeführte Fluoreszenz. UM-SCC-1-Zellen, die den Galanin-Rezeptor 2 überexzättieren, zeigten eine erhöhte Invasion der DRG im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 5G-H). Krebs-DRG-Wechselwirkung wird beobachtet, als Krebszellen eine richtungsweisende Invasion in Richtung der DRG darstellen (Abbildung 5H).
Die Datenanalyse wird auf unterschiedliche Weise durchgeführt. Die richtungsweisende Invasion von Krebszellen in Richtung der DRG wird als dichotome Variable beobachtet und die Anzahl der Eier, die dieses Invasionsmuster darstellen, wird in jeder Gruppe gezählt. Statistische Unterschiede zwischen Gruppen werden anhand eines Binomialtests von Proportionen berechnet. Die Nähe zwischen Krebszellen und DRG und Tumorbereich werden mit ImageJ6 gemessen und Unterschiede zwischen den Gruppen werden mit dem Schüler-t-Test bewertet. Um die Genauigkeit bei der ImageJ-Analyse zu gewährleisten, sollten alle Bilder aus demselben Experiment auf gleiche Licht- und Belichtungseinstellungen aufgenommen werden. Nach der Anpassung des Bildschwellenwerts und der Helligkeit aller Bilder nach denselben Kriterien wird das Werkzeug "Partikel analysieren" verwendet, um den Tumorbereich zu messen, und das lineare Messwerkzeug misst Tumor-DRG-Abstände. Es ist wichtig, die konstante Einstellung der Größe der analysierten Partikel für alle Bilder über verschiedene Gruppen hinweg zu verwenden. In einigen Fällen werden Tumore dicker und können manuell mit einem digitalen Bremssattel gemessen werden, was eine Volumenmessung ermöglicht.
Die Verwendung von Abschnitten aus paraffinintegriertem CAM-Gewebe, H&E-Färbung oder Immunhistochemie für Epithelzellen (Anti-Cytokeratin-Antikörper reaktiv für menschliche Arten) kann durchgeführt werden, was eine Bewertung der Invasion im Bindegewebe ermöglicht. Invasion wird als Anzahl der Tumorinseln im Bindegewebe pro Ei quantifiziert. Immunfluoreszenz für Kollagen IV kann verwendet werden, um die Kellermembran hervorzuheben. Auch bei Verwendung von GFP-markierten Krebszellen wird die Identifizierung dieser Zellen in den Gewebeabschnitten ohne Immunhistochemie für Cytokeratin erleichtert. Metastasen- und Angiogeneseanalysen in CAM-Experimenten werden an anderer Stelle diskutiert10,17.
Abbildung 1: Zeitachse des Experiments einschließlich der wichtigsten Schritte an den Tagen 0, 8, 10 und 17. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: DRG-Extraktion am 8. Tag . A. Ratte schaltplantisch, der die anatomische Position der Wirbelsäule veranschaulicht. B. Diagramm der Rattenwirbelkonfiguration, das verschiedene Körperregionen zeigt; grün für Gebärmutterhals, dunkelblau für Brust, Orange für Lendenwirbel und hellblau für Sakrale. C-D. Ventraler Aspekt der Brustwirbelsäule nach chirurgischer Exzision; Trennung der Regionen, wie in Bdargestellt. E. Zerlegung der Wirbel, um den Rückenmarkskanal zu öffnen, die Wirbelkörper in zwei seitliche Abschnitte mit den DRGs zu trennen. Abschnitt sollte durch den dorsalen und ventralen Aspekt jedes Wirbelknochens an der Mittellinie schneiden. F. Grosser Aspekt der geöffneten Brustwirbelsäule. G. Nachdem das Rückenmark verschoben wurde, sind DRGs in den Wirbelkanälen gut sichtbar (Pfeilspitzen, die auf 3 DRGs zeigen). H. Stereomikroskopisches Bild eines DRG (Pfeil) mit den entsprechenden Axonbündeln (Pfeilkopf). Skalenbalken: C, D, Fund G, 1 cm; H, 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zubereitung der Eier am 8. Tag. A-B. Identifizierung der Eivaskulatur und Markierungen vor dem Eingriff. Pfeile auf A zeigen auf den natürlich vorkommenden Luftsack. C-D. Bohren und Öffnen der Eierschale auf der quadratischen Öffnungsmarke. Pfeil auf D zeigt auf die intakte äußere Eierschalenmembran, nachdem die Schale mit Hilfe von stumpfen Zangen entfernt wurde. E. Das markierte Kreuz auf dem Luftsack wird mit dem Bohrer perforiert, um Luftinjederzeit in das Ei (Pfeilkopf) zu ermöglichen. 30 L HBSS-Medium wird auf die äußere Eierschalenmembran auf der quadratischen Öffnung gelegt. F. Mit einer feinen Spritzennadel wird die äußere Eischalenmembran an der Stelle perforiert, an der zuvor das HBSS platziert wurde. G. Druck wird auf eine Gummi-Augentropfenlampe ausgeübt, während sie an der Perforation befestigt wird, die auf den Luftsack gebohrt wird. Wenn der Fingerdruck freigesetzt wird, wird Luft gesaugt, wodurch ein künstlicher Luftsack (weiße Pfeile) erzeugt wird, der sich bis zum Betriebsfenster erstrecken sollte. H. Die Ränder des Betriebsfensters werden in einer fast parallelen Position zur Eierschale gebohrt, um eine versehentliche Perforation zu vermeiden. I-J. Entfernung der Eierschale mit stumpfer Zange. K. Entfernen Sie die äußere Eischalenmembran mit stumpfer Zange, wobei Sie darauf achten, keine Partikel auf das CAM einzuführen (beobachtet bei 1 cm unter der Oberfläche). L. Eier werden vorübergehend mit einer Paraffinwachsmembran bedeckt und wieder in den Brutkasten gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Grafting von DRG, Zellen und Ernte von CAM: Am Tag 8: A. CAM leicht nach Paraffinwachs-Membranentfernung beobachtet. B-C. Mit feiner Zange wird DRG auf das CAM gelegt. D. Ei wird mit Filmdressing überzogen und in den Brutkasten gelegt; Pfeile zeigen auf die abgedeckten Öffnungen. Am 10. Tag: E-F. Filmverband wird entfernt und DRG befindet sich (Pfeilkopf auf F). G-H. 5 l Zelllösung werden in einem Abstand von 2 mm zum DRG auf das CAM abgeworfen. Am 17. Tag: I-L und M-P zeigen zwei unterschiedliche Ansätze, die für die Ernte des CAM verwendet werden. I. Die Eierschale wird mit einer feinen Schere geöffnet, die auf dem Luftsack beginnt, bis die obere Hälfte des Eis entfernt ist. J. Die Eierschale, die das CAM enthält, ist auf ca. 3 cm verkleinert. K-L. Mit feiner Zange wird CAM von der Eierschale gelöst und in PFA gelegt. M-O. Die Erweiterung des Operationsfensters wird durchgeführt, um die DRG- und Krebszellen auf dem CAM zu visualisieren. Pfeilspitze zeigt auf den Tumor und Pfeil zeigt auf das DRG. P. Das CAM wird mit feinen Zangen erfasst, mit einer scharfen Schere ausgeschnitten und in PFA platziert, wie in Lgezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse. A. H&E-Abschnitt, der die Integration der DRG in das CAM zeigt. B. Höhere Vergrößerung von A; Zeigt CAM-Blutgefäße in der DRG. C. UM-SCC-1-Zellen, die auf das CAM gepfropft und vier Tage nach der Transplantation geerntet wurden (H&E-Färbung). D. Höhere Vergrößerung von C zeigt invasive Tumorinseln im CAM-Bindegewebe (Pfeile). E. Gross esteroskopisches Bild des CAM mit UM-SCC-1-GALR2-Zellen und Ratten-DRG, geerntet am 17. Tag. F. Zusammengeführte Fluoreszenz- und Hellfeldbilder, die die DRG mit roter und krebserregender Zelle mit grüner Kennzeichnung hervorheben. G-H. Fluoreszenz-Stereomikroskopie des CAM mit DRG und UM-SCC-1-GALR2 im Vergleich zu Kontrollzellen transplantiert, was die richtungsweisende Invasion von UM-SCC-1-GALR2-Zellen in die DRG (H) veranschaulicht. Skalenbalken: A-D, 500 m; E-H, 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
schritt | problem | grund | lösung | ||||||
3.2.1 | Die Embryo-Anhaftung konnte nicht identifiziert werden. | Befestigungsposition ist schwer zu sehen, während Ei noch ist. | Drehen Sie das Ei schnell seitlich, um ein langes Gefäß an der Eimembran befestigt zu sehen. | ||||||
3.3 & 3.8 | Perforation der äußeren Eierschalenmembran beim Bohren. | Falsche Positionierung des Bohrers. | Positionieren Sie den Bohrer beim Bohren fast parallel zur Eierschale. Wenn die Membran in Schritt 3.3 perforiert wird, ist es nicht erforderlich, eine weitere Perforation mit Nadel durchzuführen, wie in Schritt 3.5 angegeben. Wenn Blutungen auftreten, entsorgen Sie das Ei. | ||||||
4.3 | DRG bleibt an der Zange. | DRG ist trocken. | Nass DRG wieder in HBSS und/oder verwenden Sie eine feine Nadel, um DRG von Zangen zu lösen. | ||||||
5.2 | Zellen sind nicht perfekt mit fluoreszierendem Farbstoff gekennzeichnet. | Inkubationszeit. Einige Zellen benötigen mehr Zeit für die Beschriftung. | Halten Sie Zellen für eine zusätzliche Stunde in den Medien mit Fluoreszenzfarbstoff. | ||||||
5,6 | Luftblase auf dem Zellabfall. | Mit der gesamten Flüssigkeit in der Pipettenspitze. | Laden Sie 1 L mehr als das gewünschte Volumen und verwenden Sie nicht die endgültige L der Pipette bei der Implantation von Zellen. Dadurch werden Luftblasen im Zellmix vermieden. | ||||||
6.3 | DrG oder Zellen können bei der Ernte des CAM nicht identifiziert werden. | Kleine DRG, DRG wurde verdrängt, Krebszellen verbreiten sich. | Wenn DRG nicht gesehen wird, ernten Sie eine größere Fläche des CAM und legen Sie in einen größeren Behälter zur Fixierung. Überprüfen Sie DRG und Zellposition unter Fluoreszenz in einem Stereomikroskop, und trimmen Sie das CAM dann auf eine kleinere Größe für die Paraffineinbettung. |
Tabelle 1: Fehlerbehebungstabelle
Das hier vorgestellte CAM-DRG-In-vivo-Modell befasst sich mit den Defiziten früherer Modelle, indem es die Nerven-Tumor-Interaktion vor der physischen Invasion des Nervs durch Tumorzellen demonstriert. Die meisten In-vivo-Studien von PNI konzentrieren sich auf Tumorausbreitung und Hemmung der motorischen Funktion, und hängen von der direkten Injektion von Tumorzellen in Ischiasnerven23,24,25. Die Ischiasnerveninjektion ist ein In-vivo-Modell von PNI, bei dem Krebszellen in einen Schiasnerv der Maus oder Der Ratte injiziert werden, wo der Tumor anschließend wächst. Injektionsmodelle sind nützlich, um destruktive Tumorprogression und Schmerzen zu zeigen, die aus Tumorzellen innerhalb der Nerven entstehen. Das Ischiasnervenmodell eignet sich auch für die Untersuchung von Faktoren, die es Krebszellen ermöglichen, im Nerv zu gedeihen, aber es fehlt die Fähigkeit, die frühe Phase von PNI zu bewerten, weil es Zellen direkt in den Nerv einführt, unter Umgehung von Nervenscheiden. In einem anderen Ansatz wurden chirurgisch implantierte orthotopische Tumortransplantate verwendet, um die Bedeutung von adrenergen und cholinergen Nervenfasern bei der Förderung der Prostatakrebsprogression zu charakterisieren, was auf eine herausragende Rolle der Nerven bei der Tumorprogression hindeutet. 26. Dieses Modell bestand aus chemischer Ablation von murinen sympathischen und parasympathischen Nerven. Die parasympathischen Fasern infiltrierten Tumorgewebe, ein Prozess im Zusammenhang mit PNI, aber das Modell wurde nicht speziell verwendet, um physikalische Wechselwirkungen zwischen dem Nerv und Tumor zu bewerten. Das CAM-DRG-Modell ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Nerven und Krebs während PNI. Darüber hinaus sind murine Modelle im Vergleich zum CAM-Modell teuer und zeitaufwändig. Wir empfehlen die Verwendung des CAM-DRG-Modells für mechanistische Studien von PNI.
Einige Vorteile des CAM-DRG-Ansatzes sind die Bewertung von PNI und anderen Phänotypen, wie Tumorwachstum, Metastasierung und Angiogenese. Die Identifizierung menschlicher DNA am unteren CAM und/oder in der Leber kann zum Nachweis von Metastasen menschlicher Krebszelllinien10verwendet werden, einem empfindlicheren experimentellen Ansatz im Vergleich zu Gewebeschnitt und Färbung, der möglicherweise keine kleinen Metastasen offenbart.
Die CAM-DRG-Methode hat einige Einschränkungen, einschließlich des kurzen Beobachtungszeitrahmens. Das Immunsystem des Embryos ist physiologisch aktiv am Tag 1827, wenn Abstoßung und ein entzündlicher Prozess stattfinden können, die die experimentelle Zeit begrenzen. Es ist auch wichtig, den Abstand bei der Transplantation von Tumorzellen in der Nähe des DRG zu berücksichtigen; größere DRG-Krebsentfernungen könnten die molekularen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Nerven beeinträchtigen oder den physischen Kontakt zwischen beiden Komponenten des Modells verzögern. Auch wenn die Embryonen älter sind als in diesem Protokoll vorgesehen, könnten Embryobewegungen die Tumorzellen verdrängen. Daher ist es wichtig, Eier zu verwenden, die mit Tag 10 nach der Befruchtung für die Zelltransplantation übereinstimmen.
Da das Immunsystem vor dem 18.Tagnicht vollständig entwickelt ist, ähnelt die Tumormikroumgebung im CAM der der immunsuppressierten murinen Modelle, die häufig für Krebsstudien verwendet werden. Daher ist dieses Modell nicht nützlich, um die Rolle von Immunzellen bei der Tumorprogression zu bewerten. Eine weitere Einschränkung ist die eingeschränkte Verfügbarkeit von Reagenzien für Hühnerarten wie Antikörper, Zytokine und Primer.
Die genaue Durchführung dieses Protokolls erfordert Übung; Es kann jedoch von einem Labormitglied ohne Notwendigkeit für eine spezialisierte Kerneinrichtung durchgeführt werden. Das Bohren der Eierschale erfordert Eine Schulung. Üben auf Lebensmitteleiern (nicht befruchtet) wird empfohlen, bevor Sie dieses Modell zum ersten Mal versuchen. Ein hohes embryonales Überleben und Erfolg des Modells können erreicht werden, wenn einige kritische Schritte zur Vermeidung einer Infektion befolgt werden: angemessene Antibiotikaprophylaxe von DRGs in 2% Pen/Strep, Arbeiten in einem laminaren Strömungsschrank und Vermeidung der Dispersion von Eischalenpartikeln auf das CAM. Es ist auch wichtig, stabile Luftfeuchtigkeit während der gesamten Inkubationszeit des Eis zu halten. Wir empfehlen, die Anzahl der Eier pro Gruppe zu erhöhen, bis die Technik gemeistert ist. Die häufigsten Probleme für unerfahrenes Laborpersonal sind die Eikontamination und die ungenaue Technik bei der Zelltransplantation.
Die DRG-Ernte erfordert auch Eine Schulung; Praxis bei der Ernte von DRGs für In-vitro-Experimente8 vor dem Versuch des In-vivo-Modells wird empfohlen. Die In-vitro-DRG-Kultur ist eine Gelegenheit, die Bedingungen zu optimieren und die Technik zu verbessern, um die Dauer der DRG-Extraktion zu verkürzen. Besondere Aufmerksamkeit ist der Erntetechnik beim Greifen der DRG mit Zangen erforderlich. Die DRG sollte nicht direkt gehalten werden; Druck unter ihm aufgebracht werden. Wir empfehlen die Verwendung von Lupe, um das DRG während der Extraktion besser zu visualisieren.
Wichtig ist, dass bei der ersten Ausführung dieses Modells alle Bedingungen für die gewünschte Zelllinie optimiert werden sollten. Dieses Modell wurde für Ratten-DRG und die HNC-Zelllinie UM-SCC-1 optimiert. Die Verwendung von Maus-DRG und anderen Krebszelltypen kann eine Optimierung erfordern. Mit einer höheren Konzentration von transplantierten Zellen neigen Tumoren dazu, dicker und steifer zu werden, was Tumormessungen erleichtert. Unter Berücksichtigung mehrerer Eier für jede Gruppe und einer angemessenen Konzentration von Zellen für jedes Ei können für jedes Experiment mehrere Millionen Zellen erforderlich sein. Um die Planung zu erleichtern, sollte die Kenntnis der Verdoppelungszeit der Zellen berücksichtigt werden. Für einige wichtige Schritte in diesem Protokoll wird eine Fehlerbehebungstabelle bereitgestellt (Tabelle 1).
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Diese Arbeit wurde durch die NIH/NIDCR-Stipendien DE027551 und DE022567 (NJD) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
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