Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
הפלישה הנקבים הוא פנוטיפ אגרסיבי הראש והצוואר קרצינומה של תאים וגידולים אחרים. מודל הממברנה של האפרוח שימש ללימוד אנגיוגנזה, הפלישה לסרטן וגרורות. כאן אנו מדגימים כיצד מודל זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את הפלישה הנקבים בvivo.
הפלישה הנקבים היא פנוטיפ שבו הסרטן מקיף או פולש לעצבים. זה קשור התוצאה הקלינית הירודה של הראש והצוואר קרצינומה של תאים סרטניים אחרים. מחקרים מכניסטיים הראו כי הוצלב המולקולרי בין העצבים לתאי הגידול מתרחש לפני האינטראקציה הפיזית. יש רק כמה מודלים vivo לחקר הפלישה הנקבים, במיוחד כדי לחקור התקדמות מוקדמת, לפני אינטראקציות פיזיות הגידול הפיזי להתרחש. מודל ממברנה של האפרוח שימש לחקר הפלישה לסרטן, כי קרום המרתף של האפיתל הוריוני מחקה את זה של רקמת האפיתל האנושי. כאן אנו מחדש את מודל ממברנה האפרוח כוראלאלי לחקור הפלישה הנקבים, השתלת עכברוש בסיס שורש והראש האנושי הצוואר קרצינומה של תאים סרטניים על האפיתל כוריוני. הדגמנו כיצד מודל זה יכול להיות שימושי כדי להעריך את היכולת של תאים סרטניים לפלוש רקמות עצביות vivo.
הפלישה הנקבים (PNI) הוא הפנוטיפ מתחת למחקר בסרטן, אשר קשורה להישנות מחלות גבוהות הישרדות עניים בחולים עם הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNC)1. Pni הוא הגדיר מיקרוסקופיסטית כמו תאים סרטניים בתוך או מסביב לעצבים2,3. כאשר pni מזוהה, המטופלים צפויים לקבל טיפולים שדון כגון ניתוח בחירה בצוואר ו/או טיפול בקרינה4,5. עם זאת, טיפולים אלה הם אגרסיביים, ולא PNI ספציפי. למעשה, אין טיפול כדי לחסום PNI, בעיקר בגלל המנגנונים הבסיסיים אינטראקציות הגידול העצבי עדיין מובנים בצורה גרועה.
מנגנונים מולקולריים שונים היו מעורבים במשיכה הגידול העצבי; גידולים ותאים סטרומה שחרור נוירופפטידים וגורמי גדילה כדי לקדם neuritogenesis6,7. כאשר מתורבתים יחד בתוך מבחנה, תאים HNC ו גנגוליה שורש (DRG) שניהם יש תגובה חזקה; ההשפעות על הפלישה תא הגידול neuritogenesis ניתן לראות לאחר כמה ימים בתרבות6,8,9. עם זאת, יש חוסר מתאים במודלים vivo כדי לחבר בין אינטראקציות הגידול-עצבי לפני פלישה. כאן אנו מציגים מודל PNI vivo ללמוד אינטראקציות מוקדמות בין התאים HNC והעצבים6. התאמתי את הקרום הנשי הממברנה (CAM) מודל לכלול מרכיב עצבי, השתלת DRG ב-CAM, ואחריו השתל של תאים סרטניים לחקות מיקרוסביבה innervated הגידול.
מודל פקה שימש בהצלחה כדי להעריך את הפלישה של תאים דרך קרום המרתף, חיקוי בשלבים פולשנית מוקדם של קרצינומות ומלנומה10,11,12. CAM מורכב אפיתל כוריוני עליון, מהתערב mesenchyme, ו אפיתל allantoic נמוכה. האפיתל כוריוני הוא מבחינה מבנית דומה האפיתל האנושי10,13 בגלל קרום קולגן-IV-המרתף מדמה את קרום המרתף המפריד האפיתל אוראלי מרקמת החיבור הבסיסית. מאז שתלי הגידול הראשון בוצעו במצלמת ב 191314, עיבודים רבים של השיטה פותחו כדי לאפשר הערכה של אנגיוגנזה15,16,17, התקדמות הגידול, ו מיכלבן 18 והכי חשוב, הטכניקה של גידולים השתלה על המצלמה השתנתה מעט מאוד, אבל היישומים מתפתחים ברציפות. Assays של המורכבות הגוברת פורסמו, כולל הקרנת סמים19, רקמת עצם הנדסה20, ו מבוססי תרופות נגד סרטן21.
המעבדה שלנו משתמשת מודל CAM-DRG שבו DRG היונקים הוא מבודד מושתל על פני השטח של CAM העליון. לאחר DRG הופך משולבים ב-CAM, התאים HNC מושתלים ליד DRG ומותר לקיים אינטראקציה עם DRG לפני כולה במערכת vivo הוא נקצרו ונותחו. חשוב מכך, המערכת מאפשרת התבוננות חזותית לשעבר vivo של DRG ו הגידול על ידי תיוג הזריחה של DRG ותאים סרטניים. פרוטוקול זה כולל מספר שלבים עם רמות שונות של מורכבות שבוצעו בתוך 17 ימים, מתוך הביצים הדגירה כדי לקצור את מצלמת הסרט (איור 1). תאים המבטאים חלבונים שונים של ריבית ניתן נבדק במודל זה כדי להבהיר את מסלולים מולקולריים האחראים לפלישת העצבים בסרטן, וגם עבור תרופות הקרנה ישירות היעד הפלישה העצבית. תאים שטופלו מראש עם התרופה המועמד יכול להיות מושתל על CAM ואת המופע של PNI נחקר בהשוואה פקדים מטופלים. למעשה, מודל CAM שימש להקרנה התרופה כצעד ביניים בין מחקרים מחוץ למחקר וניסויים פרה-קליניים vivo מכרסמים ב19.
התכנון הניסיוני ישתנה עם ההשערה. למשל, אם בודקים את התפקיד של חלבון מסוים על PNI, הקבוצה הניסיונית תכלול DRG מושתל עם תאי הגידול מבטאים את החלבון, בעוד קבוצת הביקורת צריך לכלול DRG עם תאים באופן מאוד מנוכר עם וקטור ריק. ניתן להשתמש במספר עיצובים ניסיוניים שונים כדי לטפל בשאלות ספציפיות.
הצהרת האתיקה: כל הניסויים המשתמשים בחולדות בפרוטוקול זה נעשים בהתאם ל-IACUC (ועדת הטיפול המוסדי והשימוש בבעלי חיים) מהמוסד שלנו. ניסויים עם ביצים במחקר זה פטורים מרגולציה IACUC.
1. דגירה הביצית (משוער העיתוי: 5 דקות, יום אפס)
2. קציר והכנת DRGs (עיתוי משוער: 2 h, יום 8)
הערה: ניסויים עם עכברים וחולדות דורשים אישור של (IACUC). במדינות מסוימות, השימוש בביצים עוף דורש גם אישור.
3. הכנת ביצים להשתלת DRG (עיתוי משוער: 1 h עבור תריסר ביצים, יום 8)
4. השתלת מצלמה (עיתוי משוער: 40 דקות, יום 8)
5. השתלת תאי גידול במצלמת הסרט (עיתוי משוער: 1 h 30 דקות, יום 10)
6. לאסוף את המצלמה (עיתוי משוער: 1 h עבור תריסר ביצים, יום 17)
כאשר ממוטב, שיטה זו יש בקרבת 100% DRG אינטגרציה ב-CAM. תוצאות מייצגות של אינטגרציה DRG מוצגים באיור 5A-B. השילוב של DRG ב-CAM חשוב מאז הוא מספק הכדאיות של רקמת DRG במהלך הניסוי. באופן מיקרוקטאני, DRG הוא ראה בתוך רקמת החיבור של CAM (H & E כתם). כלי הדם נראים לעתים קרובות בתוך רקמת DRG, מציע כי אספקת הדם פקה מטפחת הרקמה המושתלים. גידולים מושתלים מזוהים גם על ידי מצלמת H & E; בהתאם לכמות הפלישה הנוכחית, גידולים עשויים להופיע עם אף אחד איי הגידול רבים הפולשים רקמת החיבור (איור 5C-D). הדמות הייצוגית 5E-F מראה את מצלמת מצלמה שנאספה על דימות ברייטפילד הדמיה וזריחה ממוזג. UM-SCC-1 תאים המבטא Galanin קולטן 2 הציג פלישה מוגברת של DRG בהשוואה לתאי בקרה (איור 5G-H). האינטראקציה של סרטן-DRG נצפתה כתאים סרטניים המציגים פלישה כיוונית לכיוון DRG (איור 5H).
ניתוח נתונים מבוצע בדרכים שונות. הפלישה כיוונית של תאים סרטניים לכיוון DRG הוא נצפתה כמשתנה דיכוטומי ומספר ביצים המציגות דפוס זה של הפלישה נספר בכל קבוצה. הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות מחושבים באמצעות בדיקה בינומית של פרופורציות. הקרבה בין תאים סרטניים DRG, ואזור הגידול נמדד באמצעות ImageJ6 והבדלים בין קבוצות מוערך באמצעות מבחן t של הסטודנט. כדי להבטיח דיוק בניתוח ImageJ, כל התמונות מאותו ניסוי צריכות להילקח על הגדרות אור וחשיפה שוות. לאחר התאמת סף התמונה ואת הבהירות של כל התמונות באמצעות אותם קריטריונים, הכלי לנתח חלקיקים משמש למדידת אזור הגידול והכלי מדידה ליניארי מודד מרחקים הגידול-DRG. חשוב להשתמש בכיוונון קבוע של גודל החלקיקים שנותחו עבור כל התמונות בין קבוצות שונות. במקרים מסוימים, גידולים לגדול עבה ניתן למדוד באופן ידני עם caliper דיגיטלי, המאפשר מדידת נפח.
באמצעות מקטעים של פרפין מוטבע רקמת מצלמת, H & E כתם או אימונוהיסטוכימיה עבור תאים אפיתל (נוגדן אנטי ציטוקרטין מגיב למין האנושי) ניתן לבצע, המאפשר הערכה של פלישה בתוך רקמת החיבור. הפלישה היא בכמת כמו מספר איי הגידול ברקמת החיבור לכל ביצה. Immunofluorescence עבור קולגן IV ניתן להשתמש כדי להדגיש את קרום המרתף. גם, אם שימוש בתאי סרטן המסומנים ב-GFP, זיהוי תאים אלה בסעיפים הרקמה הוא הקלה ללא אימונוהיסטוכימיה עבור ציטוקרטין. גרורות וניתוח אנגיוגנזה בניסויי קאם נדונים במקום אחר10,17.
איור 1: הניסוי ציר הזמן כולל את השלבים העיקריים בימים 0, 8, 10 ו -17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: חילוץ DRG ביום 8 . א. תרשים סכימטי הממחישות את המיקום האנטומי של עמוד השדרה. ב. דיאגרמת התצורה של חוליות החולדה המציגה אזורי גוף שונים; ירוק לצוואר הרחם, כחול כהה לחזה, כתום למותניים וכחול בהיר לחוליות סאקרל. C-D. ההיבט הגחוני של עמוד השדרה לאחר כריתה כירורגית; הפרדת האזורים כמודגם ב- B. ה. ניתוח החוליות כדי לפתוח את תעלת חוט השדרה, הפרדת הגופים החוליות לשני סעיפים צדדיים המכילים את drgs. סעיף צריך לחתוך את ההיבט הגייתי והגייתי של כל עצם החוליות באמצע הקו. ו. היבט גולמי של עמוד השדרה הפתוח של החזה. G. לאחר חוט השדרה הוא העקורים, drgs הם גלויים בקלות בתעלות החוליות (החצים מצביעים 3 drgs). H. Stereomicroscopic תמונה של drg אחד (חץ) עם חבילות אקסון המקביל (ראש החץ). סרגלי קנה מידה: C, D, F, ו- G, 1 ס מ; H, 1 מ"מ לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכנת הביצים ביום 8. א-ב. זיהוי של ביצית והסימנים לפני ההליך. חיצים על הנקודה. לגבי שק האוויר הטבעי C-D. קידוח ופתיחה של קליפת הביצה על סימון הפתיחה המרובע. חץ על D נקודות על קרום ביצה חיצונית ללא שינוי לאחר הסרת המעטפת בעזרת מלקחיים קהה. ה. הצלב המסומן על שק האוויר מחורר את המקדחה כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הביצה (ראש החץ). 30 μL של מדיום HBSS ממוקם על קרום קליפת הביצה החיצונית בפתח הכיכר. F. עם מחט מזרק קנס, קרום הביצה פגז החיצוני מחורר שבו HBSS הוצב בעבר. G. הלחץ מוחל על הנורה טפטפת גומי תוך הצמדת אותו חירור קדח על האוויר שק. כאשר הלחץ אצבע משוחרר, האוויר הוא שאבק, יצירת שק אוויר מלאכותי (חצים לבנים) כי צריך להאריך לחלון ההפעלה. ח. הקצוות של חלון ההפעלה מקדעות בתנוחה כמעט מקבילה למעטפת הביצה, כדי למנוע ניקוב מקרי. . איי. ג'יי הסרת קליפת הביצה עם מלקחיים בוטים. K. להסיר את קרום פגז ביצה חיצונית עם מלקחיים קהה, להיות זהירים לא להחדיר חלקיקים על CAM (נצפתה ב ̴1 ס מ מתחת לפני השטח). L. ביצים מכוסים באופן זמני עם קרום שעווה פרפין ולשים חזרה בחממה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השתלה של DRG, תאים, וקציר של קאם: ביום 8: A. קאם נצפתה בקלות לאחר הסרת פרפין קרום השעווה. . בי. סי עם מלקחיים עדינים, DRG ממוקם על CAM. ד. ביצה מכוסה ברוטב הסרט ומכניסים לחממה; חצים מצביעים על הפתחים המכוסים. ביום 10: E-F. ההלבשה הסרט מוסרת ו DRG ממוקם (חץ ראש על F). G-H. 5 μL של פתרון התא הוא ירד על מצלמת במרחק של ~ 2 מ"מ מ DRG. ביום 17: I-L ו -M-P להדגים שתי גישות שונות המשמשים למסוק את CAM. I. מעטפת ביצה נפתח עם מספריים קנס החל על שק האוויר קדח מחורר עד המחצית העליונה של הביצה מוסרת. J. ביצה פגז המכיל את מצלמת הוא מופחת בגודל של כ 3 ס"מ. K-L. עם מלקחיים עדינים, קאם מנותקת מקליפת הביצה וממוקמת בתוך ההמעטה. . אנימבין הרחבת חלון ההפעלה מבוצעת כדי להמחיש את התאים DRG ו סרטן על מצלמת. ראש החץ מצביע על הגידול חץ מצביע על DRG. P. THE מצלמת הוא נתפס עם מלקחיים עדינים, לגזור עם מספריים חדה, והניח בתוך כלפי מראה ב L. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות. במקטע A. H &Amp; E המציג שילוב של DRG ב-CAM. ב. הגדלה גבוהה יותר של A; חיצים להראות מצלמת כלי הדם של DRG. C. UM-scc-1 תאים הושתל על מצלמת וקצרו ארבעה ימים לאחר השתלה (H & E כתם). ד. הגדלה גבוהה יותר של C מציג איי גידול פולשנית ברקמת החיבור של CAM (חיצים). E. stereomicroscopic התמונה של מצלמת הGALR2 המושתלים עם UM-scc-1-תאים ועכבר drg, שנקטפו ביום 17. F. ממוזג ותמונות ברייטפילד הדגשת ה-drg המסומן בתאים אדומים וסרטניים המסומנים בירוק. G-H. Stereomicroscopy פלואורסצנטית של מצלמת מצוידים DRG ו-UM-SCC-1-GALR2 לעומת תאים בקרה, הממחישות הפלישה של אום-SCC-1-GALR2 תאים DRG (H). סרגלי קנה מידה: A-D, 500 μm; E-H, 2 ממ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
צעד | עיה | סיבה | פתרון | ||||||
3.2.1 | אין אפשרות לזהות את הקובץ המצורף לעובר. | קשה לראות את תנוחת ההחזקה בזמן שהביצה עדיין ממשיכה. | לסובב את הביצה במהירות הצידה כדי להיות מסוגל לראות כלי ארוך מוצמד קרום הביצה. | ||||||
3.3 & 3.8 | חירור של קרום קליפת הביצה החיצונית בזמן הקידוח. | . מיקום לא נכון של התרגיל | הצב את התרגיל כמעט במקביל למעטפת הביצה בזמן הקידוח. אם הממברנה מנוקב בשלב 3.3, אין צורך לבצע חירור נוסף עם מחט כאמור בשלב 3.5. . אם הדימום יתרחש, מחק את הביצה | ||||||
4.3 | . DRG נדבק למלקחיים | DRG יבש. | DRG רטוב שוב ב HBSS ו/או להשתמש מחט קנס כדי לעזור לנתק DRG מ מלקחיים. | ||||||
5.2 | תאים אינם מתויגים באופן מושלם עם צבע פלורסנט. | . זמן דגירה תאים מסוימים דורשים יותר זמן לתווית. | שמור על תאים למשך שעה נוספת במדיה עם צבע פלורסנט. | ||||||
5.6 | . בועת אוויר על טיפת התאים | משתמש בכל הנוזלים. בקצה הפיפטה | טען 1μL יותר מאמצעי האחסון הרצוי ואל תשתמש ב-μL הסופי של הפיפטה בעת השתלת תאים. זה ימנע בועות האוויר בתערובת התאים. | ||||||
6.3 | אין אפשרות לזהות את התאים DRG או לאחר איסוף המצלמה. | קטן DRG, DRG יש נעקרו, תאים סרטניים להתפשט. | אם DRG לא נראה, הקציר שטח גדול יותר של מצלמת ומקום לתוך מיכל גדול יותר עבור קיבעון. בדוק DRG ומיקום התא תחת הזריחה במיקרוסקופ סטריאו, ולאחר מכן לקצץ את מצלמת בגודל קטן יותר עבור הטבעה פרפין. |
טבלה 1: הטבלה ' פתרון בעיות '
The CAM-DRG ב vivo מודל הציג כאן כתובות החסרונות של הדגמים הקודמים על ידי הוכחת אינטראקציה של גידול עצבי לפני פלישה פיזית של העצב על ידי תאים סרטניים. רוב במחקרים vivo של pni להתמקד על התפשטות הגידול ועיכוב של תפקוד המנוע, תלוי בהזרקה ישירה של תאים סרטניים לתוך עצבי הירך23,24,25. הזרקת העצב הסימתי הוא מודל vivo של PNI שבו תאים סרטניים מוזרק לתוך עכבר או עצב מגיד עכברוש שבו הגידול לאחר מכן גדל. מודלים הזרקה שימושיים כדי להציג התקדמות הגידול הרסני כאב וכתוצאה מתאי הגידול בתוך העצבים. המודל העצבי מתאים גם למחקר של גורמים המאפשרים תאים סרטניים לשגשג בעצב אבל חסר את היכולת להעריך את השלב המוקדם של PNI, כי הוא מציג תאים ישירות לתוך העצב, לעקוף נרתיקים עצביים. בגישה שונה, מושתל בניתוח שתלי הגידול אורתוטופית שימשו כדי לאפיין את החשיבות של אדררורגיות וסיבי עצב cholinergic בקידום התקדמות סרטן הערמונית, ובכך מציע תפקיד בולט של עצבים התקדמות הגידול 26. מודל זה כללה אבלציה כימית של עצבים מורקיים ומעורר חמלה פאראסימפתטית. הסיבים הפאראסימפתטית חדרו לרקמות הגידול, תהליך הקשור PNI, אבל המודל לא היה משמש במיוחד כדי להעריך את האינטראקציות הפיזיות בין העצב לבין הגידול. מודל CAM-DRG מאפשר חקירה של אינטראקציות בין העצב והסרטן במהלך PNI. יתר על כן, מודלים murine הם יקרים וגוזלת זמן בהשוואה למודל CAM. אנו ממליצים להשתמש בדגם CAM-DRG למחקרים מכניסטיים של PNI.
כמה יתרונות לגישה CAM-DRG כוללים הערכה של PNI ופנוטיפים אחרים, כגון גידול גידול, גרורות, ואנגיוגנזה. זיהוי של ה-DNA האנושי על מצלמת התחתון ו/או בכבד יכול לשמש לאיתור גרורות של שורות התאים של סרטן האדם10, גישה ניסיונית יותר רגיש בהשוואה לסקר רקמות וכתמים, אשר עשוי לא לחשוף גרורות קטנות.
לשיטת CAM-DRG יש מספר מגבלות, כולל מסגרת זמן התבוננות קצרה. המערכת החיסונית של העובר הוא פעיל מבחינה פיזיולוגית על ידי יום 1827, כאשר דחייה ותהליך דלקתי עשוי להתרחש, הגבלת זמן ניסיוני. חשוב גם לשקול את המרחק כאשר השתלת תאים סרטניים קרוב DRG; מרחקים גדולים יותר DRG-cancer עלול לפגוע באינטראקציות המולקולריות בין תאי הגידול והעצב, או יכול לעכב את המגע הפיזי בין שני המרכיבים של המודל. כמו כן, אם העוברים ישנים יותר מאשר האמור בפרוטוקול זה, תנועות העובר עלול לתפוס את תאי הגידול. לכן, חשוב להשתמש בביצים עקבית עם יום 10 לאחר הפריה עבור השתלת תאים.
מאז המערכת החיסונית אינה מפותחת לגמרי לפני יום 1827, הסביבה מיקרוסביבתית של מצלמת דומה לזה של מודלים מורקיים החיסוני משמש לעתים קרובות ללימודי סרטן. לכן, מודל זה אינו שימושי כדי להעריך את התפקיד של תאים חיסוניים בהתקדמות הגידול. מגבלה נוספת היא הזמינות המוגבלת של ריאגנטים למיני עוף, כגון נוגדנים, ציטוקינים וצבעי יסוד.
ביצוע מדויק של פרוטוקול זה דורש תרגול; עם זאת, זה יכול להיעשות על ידי חבר מעבדה ללא צורך במתקן הליבה המקצועית. קידוח מעטפת הביצית דורש הכשרה. מומלץ להתאמן על ביצי מכולת (לא מופרות) לפני שמנסים לבצע מודל זה בפעם הראשונה. הישרדות עובריים גבוהה והצלחה של המודל יכול להיות מושגת אם כמה צעדים קריטיים כדי למנוע זיהום מלווה: מניעה אנטיביוטי מתאים של DRGs ב 2% עט/דלקת, עובד בארון הזרם למינארי, והימנעות הפיזור של חלקיקים פגז ביצה על המצלמה. זה גם חיוני כדי לשמור על לחות יציבה במהלך הזמן דגירה הביצית הכוללת. אנו ממליצים להגדיל את מספר הביצים לכל קבוצה עד שתהיה שליטה בטכניקה. הבעיות השכיחות ביותר עבור אנשי מעבדה לא מנוסים הם זיהום ביצים טכניקה מדויקת עבור השתלת תאים.
קציר DRG גם דורש הכשרה; מומלץ לאסוף DRGs לניסויים בתחום החוץ הגופית8 לפני שמנסים לvivo במודל. תרבות DRG מתורבת היא הזדמנות למטב את התנאים ולשפר את הטכניקה כדי לקצר את משך החילוץ DRG. תשומת לב מיוחדת לאסוף טכניקה נדרשת כאשר אוחז את DRG עם מלקחיים. אין להחזיק את ה-DRG ישירות; לחץ צריך להיות מיושם מתחתיו. אנו ממליצים להשתמש בעדשת מגדלת כדי להמחיש טוב יותר את DRG במהלך החילוץ.
חשוב מכך, בעת ביצוע מודל זה בפעם הראשונה, כל התנאים צריכים להיות ממוטבים עבור קו התא הרצוי. מודל זה היה אופטימיזציה עבור עכברוש DRG ו קו HNC תא UM-SCC-1. השימוש בעכבר DRG וסוגים אחרים של תאים סרטניים עשויים לדרוש אופטימיזציה. עם ריכוז גבוה יותר של תאים מושתלים, גידולים נוטים לצמוח עבה יותר stiffer, אשר מקלה על מדידות הגידול. התחשבות בביצים מרובות עבור כל קבוצה וריכוז מתאים של תאים עבור כל ביצה, כמה מיליוני תאים עשויים להידרש עבור כל ניסוי. כדי להקל על תכנון, הידע של זמן ההכפלה של התאים יש לקחת בחשבון. עבור חלק מהשלבים הקריטיים בפרוטוקול זה, מסופקת טבלת פתרון בעיות (טבלה 1).
המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
עבודה זו נתמכת על ידי NIH/נדבך מענקים DE027551 ו-DE022567 (NJD).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved