Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
Периневрального вторжения является агрессивным фенотипом для головы и шеи плоскоклеточной карциномы и других опухолей. Модель хориоаллантоической мембраны была использована для изучения ангиогенеза, рака и метастазов. Здесь мы демонстрируем, как эта модель может быть использована для оценки периневрального вторжения in vivo.
Периневрневенное вторжение является фенотипом, в котором рак окружает или вторгается в нервы. Это связано с плохим клиническим исходом для головы и шеи плоскоклеточной карциномы и других видов рака. Механистические исследования показали, что молекулярный перекрестный разговор между нервами и опухолевыми клетками происходит до физического взаимодействия. Есть только несколько моделей in vivo для изучения периневрального вторжения, особенно для исследования раннего прогрессирования, прежде чем физические нервные опухоли взаимодействия происходят. Модель хориоаллантоической мембраны была использована для изучения вторжения рака, потому что мембрана в подвале хорионического эпителия имитирует эпитилию человека. Здесь мы перепрофилировали цыпленок chorioallantoic мембранной модели для расследования периневрального вторжения, прививки крыс ывата корневой ганглии и головы человека и шеи плоскоклеточной клетки карциномы на хорионический эпителий. Мы продемонстрировали, как эта модель может быть полезна для оценки способности раковых клеток вторгаться в нервную ткань in vivo.
Периневрального вторжения (PNI) является недостаточно изученным фенотипом при раке, который связан с высокой рецидивом заболевания и плохой выживаемостью у пациентов с плоскоклеточной карциномой головы и шеи (HNC)1. PNI определяется микроскопически как опухолевые клетки внутри или вокруг нервов2,3. Когда PNI обнаружен, пациенты, скорее всего, получить адъювантной терапии, такие как факультативное вскрытие шеи и / или лучевой терапии4,5. Тем не менее, эти методы лечения являются агрессивными, а не PNI-специфических. В самом деле, нет терапии, чтобы блокировать PNI, в первую очередь потому, что механизмы, лежащие в основе нервно-опухолевых взаимодействий по-прежнему плохо изучены.
Различные молекулярные механизмы были вовлечены в нервно-опухолевого притяжения; опухоли и стромальные клетки релиз нейропептидов и факторов роста для содействия неуритогенез6,7. При культивировании вместе in vitro, клетки HNC и дорсальные корневые ганглии (DRG) оба имеют надежный ответ; влияние на вторжение опухолевых клеток и неуритогенез можно увидеть через несколько дней в культуре6,8,9. Тем не менее, существует отсутствие соответствующих моделей in vivo для повторения взаимодействия опухоли и нерва до вторжения. Здесь мы представляем in vivo PNI модель для изучения ранних взаимодействий между клетками HNC и нервами6. Мы адаптировали модель хориоаллантоической мембраны (CAM), чтобы включить нейронный компонент, прививку DRG в CAM, а затем трансплантат раковых клеток, чтобы имитировать иннерватированную микросреду опухоли.
Модель CAM была успешно использована для оценки вторжения клеток через мембрану подвала, имитируя ранние инвазивные стадии карциномы и меланомы10,11,12. CAM состоит из верхнего хорионического эпителия, вмешиваясь мезенхим, и нижней аллантоической эпителия. Хорионический эпителий структурно похож на человеческий эпителий10,13 в том, что коллаген-IV богатых подвале мембраны имитирует подвал мембраны, которая отделяет устные эпителия от основной соединительной ткани. Так как первые опухолевые трансплантаты были выполнены в CAM в 191314, многие адаптации метода были разработаны, чтобы позволить для оценки ангиогенеза15,16,17, прогрессирование опухоли, и метастаз18. Важно отметить, что техника прививки опухолей на CAM изменилась очень мало, но приложения постоянно развиваются. Анализы растущей сложности были опубликованы, в том числе скрининг аткан19, костной ткани инженерных20, и наночастицы на основе противораковых препаратов21.
Наша лаборатория использует модель CAM-DRG, в которой млекопитающее DRG изолировано и привито на поверхности верхнего CAM. После того, как DRG становится включенвв в CAM, клетки HNC прививаются вблизи DRG и позволяют взаимодействовать с DRG до того, как вся система in vivo будет собрана и проанализирована. Важно отметить, что система позволяет ex-vivo визуальное наблюдение как DRG и опухоли флуоресценции маркировки DRG и опухолевых клеток. Этот протокол включает в себя несколько шагов с различными уровнями сложности выполняется в течение 17 дней, от инкубации яиц для сбора CAM (Рисунок 1). Клетки, выражающие различные белки, представляющие интерес, могут быть протестированы в этой модели, чтобы выяснить молекулярные пути, ответственные за вторжение нерва в рак, а также для скрининга препаратов непосредственно целевой нейронной вторжения. Клетки предварительно обработанные с наркотиком кандидата могут быть привиты на CAM и появление PNI исследовали по сравнению с необработанным контроля. В самом деле, модель CAM была использована для скрининга наркотиков в качестве промежуточного шага между in vitro исследований и доклинических испытаний in vivo у грызунов19.
Экспериментальная конструкция будет варьироваться в зависимости от гипотезы. Например, при тестировании роли конкретного белка на ПНИ, экспериментальная группа будет включать DRG привитых с опухолевыми клетками, перевыражающими белок, в то время как контрольная группа должна включать DRG с клетками, стабилизированными пустым вектором. Для решения конкретных вопросов можно использовать несколько различных экспериментальных проектов.
Заявление об этике: Все эксперименты с использованием крыс в этом протоколе проводятся в соответствии с правилами IACUC (Институциональный комитет по уходу за животными и использованию) нашего учреждения. Эксперименты с яйцами в этом исследовании освобождаются от регулирования IACUC.
1. Инкубация яйцеклеток (оценочное время: 5 мин, ноль дня)
2. Урожай и подготовка DRGs (оценочное время: 2 ч, день 8)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с мышами и крысами требуют одобрения со стороны (IACUC). В некоторых странах использование куриных яиц также требует одобрения.
3. Приготовление яиц для прививки DRG (оценочное время: 1 ч для десятка яиц, день 8)
4. Прививка DRG на CAM (оценочное время: 40 мин, день 8)
5. Прививка опухолевых клеток на CAM (оценочное время: 1 ч 30 мин, день 10)
6. Сбор CAM (оценочный срок: 1 ч для десятка яиц, день 17)
При оптимизации этот метод имеет около 100% интеграции DRG в CAM. Репрезентативные результаты интеграции DRG показаны на рисунке 5A-B. Интеграция DRG в CAM имеет важное значение, поскольку она обеспечивает жизнеспособность ткани DRG во время эксперимента. Микроскопически, DRG рассматривается в соединительной ткани CAM (H и E пятно). Кровеносные сосуды часто видели внутри ткани DRG, предполагая, что CAM кровоснабжения является воспитание привитых тканей. Имплантированные опухоли также идентифицируются на CAM H и E; в зависимости от того, сколько вторжения присутствует, опухоли могут представлять ни с одним из многочисленных островов опухоли вторжения соединительной ткани(Рисунок 5C-D). Представитель Рисунок 5E-F показывает собранный CAM на ярком поле изображения и слилась флуоресценции. UM-SCC-1 клетки overexpressing Галанин рецептор 2 представлены увеличение вторжения DRG по сравнению с контрольными клетками(Рисунок 5G-H). Рак-DRG взаимодействия наблюдается как раковые клетки, представляющие направленное вторжение к DRG(Рисунок 5H).
Анализ данных выполняется по-разному. Направленное вторжение раковых клеток к DRG наблюдается как дихотомическая переменная, и количество яиц, представляющих эту модель вторжения, учитывается в каждой группе. Статистические различия между группами рассчитываются с помощью биномиального теста пропорций. Близость между раковыми клетками и DRG, и область опухоли измеряются с помощью ImageJ6 и различия между группами оцениваются с помощью т-теста студента. Для обеспечения точности с помощью анализа ImageJ все изображения из одного и того же эксперимента должны быть сделаны на одинаковом освещении и настройках экспозиции. После корректировки порога изображения и яркости всех изображений с использованием одних и тех же критериев, инструмент анализа частиц используется для измерения области опухоли, а линейный инструмент измерения измеряет расстояния опухоли-DRG. Важно использовать постоянную установку размера частиц, анализируемых для всех изображений в разных группах. В некоторых случаях опухоли становятся толще и могут быть измерены вручную с помощью цифрового калибра, что позволяет измерять объем.
Использование разделов парафина встроенных CAM ткани, Н И E пятно или иммуногистохимия для эпителиальных клеток (анти-цитокератин антитела реактивной для человеческого вида) может быть выполнена, что позволяет оценить вторжение в соединительной ткани. Вторжение количественно, как количество опухолевых островов в соединительной ткани на яйцо. Иммунофлуоресценция для коллагена IV может быть использована для выделения мембраны подвала. Кроме того, при использовании GFP помечены раковые клетки, идентификация этих клеток в секциях тканей облегчается без иммуногистохимии для цитокератина. Метастаз и ангиогенез анализ в CAM эксперименты обсуждаются в другом месте10,17.
Рисунок 1: Временная шкала эксперимента, включающая основные шаги в дни 0, 8, 10 и 17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: добыча DRG на 8-й день . A. Крыса схематика, иллюстрирующая анатомическое расположение позвоночника. B. Диаграмма конфигурации крысиных позвонков, показывающая различные области тела; зеленый для шейки матки, темно-синий для грудной клетки, оранжевый для поясничных и светло-голубой для крестцовых позвонков. C-D. Вентральный аспект крысиного позвоночника после хирургического иссечения; разделение регионов, как показано в B. E.Рассечение позвонков, чтобы открыть канал спинного мозга, разделяя позвонков органов на два боковых разделов, содержащих DRGs. Раздел должен прорезать спинной и вентральный аспект каждой позвоночной кости в средней линии. F. Валовой аспект открытого грудного отдела позвоночника. G. После того, как спинной мозг смещен, DRGs легко видны в позвоночных каналах (стрелка головы указывая 3 DRGs). H. Стереомикроскопическое изображение одного DRG (стрелка) с соответствующими аксонными пучками (стрелка головка). Шкала баров: C, D, F, и G, 1 см; H, 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Приготовление яиц на 8-й день. А-Б. Идентификация сосуды яичных и маркировки до процедуры. Стрелки на точке естественно происходящих воздушный мешок. C-D. Бурение и открытие яичной скорлупы на квадратной отметке открытия. Стрелка на D указывает на нетронутую внешнюю мембрану яичной скорлупы после удаления скорлупы с помощью тупых щипушек. E. Отмеченный крест на воздушном мешке перфорирован с дрелью, чтобы позволить поток воздуха в яйцо (стрелка головы). 30 зЛ среды HBSS помещается на внешнюю мембрану яичной скорлупы на квадратном открытии. F. С тонкой шприцевой иглой, внешняя мембрана яичной скорлупы перфорирована там, где ранее был помещен HBSS. G. Давление наносится на резиновую лампу eyedropper при присоединении его к перфорации, пробуренной на воздушном мешке. Когда давление пальца высвобождается, воздух пылесосится, создавая искусственный воздушный мешок (белые стрелки), который должен распространяться на операционное окно. H. Края рабочего окна просверливаются в почти параллельном положении с яичной скорлупой, чтобы избежать случайной перфорации. I-J. Удаление яичной скорлупы тупыми щипками. K. Удалите наружную мембрану яичной скорлупы тупыми щипками, стараясь не вводить частицы на CAM (наблюдаемый на 1 см ниже поверхности). Яйца L. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Прививка DRG, клетки, и уборка CAM: На 8-й день: A. CAM легко наблюдается после удаления парафиновой восковой мембраны. B-C. С тонкими щипками, DRG помещается на CAM. D. Яйцо покрывается пленочным соусом и помещается в инкубатор; стрелки указывают на отверстия, которые покрыты. На 10-й день: E-F. Пленка повязка удаляется и DRG находится (стрелка головка на F). G-H. 5 qL клеточного раствора сбрасывается на CAM на расстоянии 2 мм от DRG. На 17-й день: I-L и M-P демонстрируют два различных подхода, используемых для сбора CAM. I. Яичная скорлупа открывается тонким ножницами, начиная с воздушного мешка пробуренной перфорации до тех пор, пока верхняя половина яйца не будет удалена. J. Яичная оболочка, содержащая CAM уменьшается в размерах примерно до 3 см. K-L. С тонкими щипками, CAM отделяется от яичной скорлупы и помещается в PFA. М-О. Расширение операционного окна выполняется для визуализации DRG и раковых клеток на CAM. Стрелка указывает на опухоль, а стрелка указывает на DRG. P. CAM схватил с тонкими щипками, вырезать с острыми ножницами, и помещен ы в PFA, как показано в L. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Результаты представитель. A. Н И Е раздел, показывающий интеграцию DRG в CAM. B. Высшее увеличение A; стрелки показывают CAM кровеносные сосуды в DRG. C. UM-SCC-1 клетки привиты на CAM и собрали через четыре дня после прививки (H и E пятно). D. Высшее увеличение C, показывающее инвазивные опухолевые острова в соединительной ткани CAM (стрелки). E. Гросс стереомикроскопическое изображение CAM, привитого с UM-SCC-1-GALR2 клеток и крыс DRG, собранные на 17-й день. F.Слияние флуоресценции и ярко-поле изображения подчеркнув DRG помечены красным цветом и раковые клетки помечены зеленым цветом. G-H. Флуоресценция стереомикроскопия CAM привитых с DRG и UM-SCC-1-GALR2 против контрольных элементов, иллюстрирующие направленное вторжение UM-SCC-1-GALR2 клеток в DRG (H). Шкала баров: A-D, 500 мкм; E-H, 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Шаг | Проблема | Причина | Решение | ||||||
3.2.1 | Невозможно определить привязанность эмбриона. | Положение привязанности трудно увидеть в то время как яйцо все еще. | Поверните яйцо быстро боком, чтобы иметь возможность увидеть длинный сосуд, прикрепленный к яйцеклетке мембраны. | ||||||
3.3 и 3.8 | Перфорация наружной мембраны яичной скорлупы во время бурения. | Неправильное позиционирование сверла. | Расположите сверло почти параллельно яичной скорлупе во время бурения. Если мембрана перфорирована в шаге 3.3, нет необходимости выполнять дальнейшую перфорацию с помощью иглы, как указано в шаге 3.5. Если кровотечение происходит, отбросить яйцо. | ||||||
4,3 | DRG прилипает к щипкам. | DRG сухой. | Влажный DRG снова в HBSS и / или использовать тонкую иглу, чтобы помочь отделить DRG от щипцы. | ||||||
5.2 | Клетки не идеально помечены флуоресцентным красителем. | Время инкубации. Некоторые клетки требуют больше времени для маркировки. | Держите клетки в течение дополнительного часа в средствах массовой информации с флуоресцентным красителем. | ||||||
5.6 | Воздушный пузырь на клеточной капле. | Использование всей жидкости в наконечнике пипетки. | Загрузите на 1 л больше, чем желаемый объем, и не используйте окончательный КЛ пипетки при имплантации клеток. Это позволит избежать пузырьков воздуха в клетках смеси. | ||||||
6,3 | Невозможно определить DRG или клетки при сборе CAM. | Малый DRG, DRG получил смещения, раковые клетки распространения. | Если DRG не видел, урожай большей площади CAM и место в большой контейнер для фиксации. Проверьте DRG и положение клеток под флуоресценцией в стерео микроскоп, а затем обрезать CAM до меньшего размера для встраивания парафина. |
Таблица 1: Таблица для устранения неполадок
Представленная здесь модель CAM-DRG in vivo устраняет дефицит предыдущих моделей, демонстрируя нервно-опухолевое взаимодействие до физического вторжения нерва опухолевыми клетками. Большинство in vivo исследования PNI сосредоточиться на распространении опухоли и ингибирование двигательной функции, и зависит от прямого впрыска опухолевых клеток в седализаторы23,24,25. Инъекции седалищного нерва является in vivo модель PNI, где раковые клетки вводятся в мышь или крысиный седалищный нерв, где опухоль впоследствии растет. Инъекционные модели полезны, чтобы показать разрушительное прогрессирование опухоли и боль в результате опухолевых клеток в нервах. Седалитовый нерв модель также подходит для изучения факторов, которые позволяют раковые клетки процветать в нерва, но не хватает способности оценить раннюю фазу PNI, потому что он вводит клетки непосредственно в нерв, минуя нервных оболочек. В другом подходе, хирургически имплантированные ортотопические опухолевые трансплантаты были использованы для характеристики важности адренергических и холинергических нервных волокон в содействии прогрессированию рака простаты, тем самым предлагая заметную роль нервов в прогрессии опухоли 26. Эта модель состояла из химической абляции мурин симпатических и парасимпатических нервов. Парасимпатические волокна проникли опухолевых тканей, процесс, связанный с PNI, но модель не была специально использована для оценки физических взаимодействий между нервом и опухолью. Модель CAM-DRG позволяет проводить исследование взаимодействий между нервом и раком во время PNI. Кроме того, модели murine являются дорогостоящими и трудоемкими по сравнению с моделью CAM. Мы предлагаем использовать модель CAM-DRG для механистических исследований ПНИ.
Некоторые преимущества подхода CAM-DRG включают оценку ПНИ и других фенотипов, таких как рост опухоли, метастаз и ангиогенез. Идентификация ДНК человека на нижнем CAM и / или в печени может быть использована для обнаружения метастазов человеческих раковых клеток линий10, более чувствительный экспериментальный подход по сравнению с тканей секции и окрашивания, которые не могут выявить небольшие метастазовые.
Метод CAM-DRG имеет некоторые ограничения, включая короткий срок наблюдения. Иммунная система эмбриона физиологически активна к18-27дню, когда может происходить отторжение и воспалительный процесс, ограничивающий экспериментальное время. Важно также учитывать расстояние при прививке опухолевых клеток, близких к DRG; большие расстояния DRG-рака могут ухудшить молекулярные взаимодействия между опухолевыми клетками и нервом, или может задержать физический контакт между обоими компонентами модели. Кроме того, если эмбрионы старше, чем предусмотрено в этом протоколе, эмбрион движения могут вытеснить опухолевые клетки. Поэтому важно использовать яйца в соответствии с днем 10 после оплодотворения для клеточной прививки.
Так как иммунная система не полностью развита до дня 1827, микроокружение опухоли в CAM похож на иммунодепрессированных моделей мурин часто используется для исследований рака. Поэтому эта модель не полезна для оценки роли иммунных клеток в прогрессировании опухоли. Другим ограничением является ограниченное наличие реагентов для видов кур, таких как антитела, цитокины и грунтовки.
Точное выполнение этого протокола требует практики; однако это может быть сделано сотрудником лаборатории без необходимости в специализированном базовом учреждении. Бурение яичной скорлупы требует обучения. Практика на продуктовых (неоплодотворенных) яйца рекомендуется, прежде чем пытаться эту модель в первый раз. Высокая эмбриональная выживаемость и успех модели могут быть достигнуты, если будут предприняты некоторые критические шаги, чтобы избежать инфекции: соответствующая антибиотикопрофилактика DRGs в 2% Pen/Strep, работающая в ламинарном шкафу потока, и избегающая рассеивания частиц яичной скорлупы на CAM. Также важно поддерживать стабильную влажность во время общего времени инкубации яйцеклеток. Мы рекомендуем увеличить количество яиц на группу до тех пор, пока техника не будет освоена. Наиболее частыми проблемами для неопытного персонала лаборатории являются заражение яйцами и неточная методика прививки клеток.
Сбор урожая DRG также требует профессиональной подготовки; практика в сборе DRGs для экспериментов в пробирке8 перед попыткой in vivo модель рекомендуется. Культура in vitro DRG – это возможность оптимизировать условия и улучшить технику сокращения продолжительности добычи DRG. Особое внимание требуется технике уборки при захвате DRG с помощью щипцев. DRG не должно проводиться непосредственно; под ним следует применять давление. Мы рекомендуем использовать увеличительное линза для лучшей визуализации DRG во время извлечения.
Важно отметить, что при первом выполнении этой модели все условия должны быть оптимизированы для нужной клеточной линии. Эта модель была оптимизирована для крыс DRG и hnC клеточной линии UM-SCC-1. Использование мыши DRG и других типов раковых клеток может потребовать оптимизации. С более высокой концентрацией привитых клеток, опухоли, как правило, растут толще и жестче, что облегчает измерения опухоли. Принимая во внимание несколько яиц для каждой группы и соответствующую концентрацию клеток для каждого яйца, несколько миллионов клеток может потребоваться для каждого эксперимента. Для облегчения планирования следует принимать во внимание информацию о времени удвоения клеток. Для некоторых критических шагов в этом протоколе предусмотрена таблица устранения неполадок(таблица 1).
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Эта работа была поддержана NIH/NIDCR гранты DE027551 и DE022567 (NJD).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved