Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Medicine
La invasión perineuronal es un fenotipo agresivo para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello y otros tumores. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar angiogénesis, invasión de cáncer, y metástasis. Aquí demostramos cómo este modelo se puede utilizar para evaluar la invasión perineural in vivo.
La invasión perineuronal es un fenotipo en el que el cáncer rodea o invade los nervios. Se asocia con un mal resultado clínico para el carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y otros tipos de cáncer. Estudios mecánicos han demostrado que la interferencia molecular entre los nervios y las células tumorales se produce antes de la interacción física. Sólo hay unos pocos modelos in vivo para estudiar la invasión perineural, especialmente para investigar la progresión temprana, antes de que se produzcan interacciones físicos nervio-tumor. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar la invasión del cáncer, porque la membrana del sótano del epitelio corético imita la del tejido epitelial humano. Aquí reutilizamos el modelo de membrana corioalantoica de polluelos para investigar la invasión perineural, injertando ganglios de raíz dorsal de rata y células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humanos en el epitelio corético. Hemos demostrado cómo este modelo puede ser útil para evaluar la capacidad de las células cancerosas para invadir el tejido neural in vivo.
La invasión perineural (PNI) es un fenotipo poco estudiado en el cáncer, que se asocia con una alta recurrencia de la enfermedad y una mala supervivencia en pacientes con carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (HNC)1. La PNI se define microscópicamentecomo células tumorales dentro o alrededor de los nervios 2,3. Cuando se detecta PNI, es probable que los pacientes reciban terapias adyuvantes como disección electiva del cuello y/o radioterapia4,5. Sin embargo, estas terapias son agresivas y no específicas de la PNI. De hecho, no existe una terapia para bloquear la PNI, principalmente porque los mecanismos subyacentes a las interacciones nervio-tumoral todavía se entienden mal.
Diferentes mecanismos moleculares se han implicado en la atracción nervio-tumor; tumores y células estromales liberan neuropéptidos y factores de crecimiento para promover la neuritogénesis6,7. Cuando se cultivan juntos in vitro, las células HNC y los ganglios de raíz dorsal (DRG) tienen una respuesta robusta; efectos sobre la invasión de células tumorales y la neuritogénesis se pueden ver después de unos días en el cultivo6,8,9. Sin embargo, hay una falta de modelos in vivo apropiados para recapitular las interacciones tumor-nervio antes de la invasión. Aquí presentamos un modelo in vivo PNI para estudiar lasinteracciones tempranas entre las células HNC y los nervios 6. Adaptamos el modelo de membrana corioalantoica de polluelos (CAM) para incluir un componente neural, injertando un DRG en el CAM, seguido de un injerto de células cancerosas para imitar un microambiente tumoral inervado.
El modelo CAM se ha utilizado con éxito para evaluar la invasión de células a través de la membrana del sótano, imitando las primeras etapas invasivas de carcinomas y melanoma10,11,12. El CAM se compone de epitelio coriónónico superior, mesenquime intermedio y epitelio alantoico inferior. El epitelio coriónónico es estructuralmente similar al epitelio humano10,13 en que la membrana del sótano rica en colágeno-IV simula la membrana del sótano que separa el epitelio oral del tejido conectivo subyacente. Desde que se realizaron los primeros injertos tumorales en la CAM en 191314,se desarrollaron muchas adaptaciones del método para permitir la evaluación de la angiogénesis15,16,17,progresión tumoral, y metástasis18. Es importante destacar que la técnica de injertar tumores en el CAM ha cambiado muy poco, pero las aplicaciones están evolucionando continuamente. Se han publicado ensayos de creciente complejidad, incluyendo el cribado de fármacos19,la ingeniería de tejidoó óseo20y los fármacos anticancerígenos basados en nanopartículas21.
Nuestro laboratorio utiliza un modelo CAM-DRG en el que un DRG de mamífero es aislado e injertado en la superficie de la CAM superior. Después de que el DRG se incorpore en el CAM, las células HNC se injertan cerca del DRG y se les permite interactuar con el DRG antes de que todo el sistema in vivo sea cosechado y analizado. Es importante destacar que el sistema permite la observación visual ex-vivo tanto del DRG como del tumor mediante el etiquetado de fluorescencia de DRG y células tumorales. Este protocolo comprende múltiples pasos con diferentes niveles de complejidad realizados en un plazo de 17 días, desde la incubación de huevos hasta la cosecha del CAM (Figura1). Las células que expresan diferentes proteínas de interés se pueden probar en este modelo para dilucidar las vías moleculares responsables de la invasión nerviosa en el cáncer, y también para la detección de fármacos para apuntar directamente a la invasión neuronal. Las células pretratadas con un medicamento candidato se pueden injertar en el CAM y la aparición de PNI investigada en comparación con los controles no tratados. De hecho, el modelo CAM se ha utilizado para la detección de fármacos como paso intermedio entre estudios in vitro y ensayos preclínicos in vivo en roedores19.
El diseño experimental variará con la hipótesis. Por ejemplo, si se prueba el papel de una proteína específica en la PNI, el grupo experimental incluiría DRG injertado con células tumorales que sobreexpresan la proteína, mientras que el grupo de control debe incluir DRG con células establemente transtrinfectadas con vector vacío. Se pueden utilizar varios diseños experimentales diferentes para abordar preguntas específicas.
Declaración de ética: Todos los experimentos que utilizan ratas en este protocolo se realizan de acuerdo con las reglas del IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso animal) de nuestra institución. Los experimentos con huevos en este estudio están exentos de la regulación de la IACUC.
1. Incubación de huevos (tiempo estimado: 5 min, día cero)
2. Cosecha y preparación de DRGs (tiempo estimado: 2 h, día 8)
NOTA: Los experimentos con ratones y ratas requieren la aprobación de la (IACUC). En algunos países, el uso de huevos de pollo también requiere aprobación.
3. Preparación de huevos para el injerto de DRG (tiempo estimado: 1 h para una docena de huevos, día 8)
4. Injerto de DRG en el CAM (tiempo estimado: 40 min, día 8)
5. Injerto de células tumorales en el CAM (tiempo estimado: 1 h 30 min, día 10)
6. Cosecha de la CAM (tiempo estimado: 1 h para la docena de huevos, día 17)
Cuando se optimiza, este método tiene casi 100% de integración DRG en el CAM. Los resultados representativos de la integración de DRG se muestran en la Figura 5A-B. La integración de DRG en el CAM es importante ya que proporciona viabilidad al tejido DRG durante el experimento. Microscópicamente, el DRG se ve dentro del tejido conectivo del CAM (mancha H&E). Los vasos sanguíneos se ven a menudo dentro del tejido DRG, lo que sugiere que el suministro de sangre CAM está nutriendo el tejido injertado. Los tumores implantados también se identifican en el CAM por H&E; dependiendo de la cantidad de invasión presente, los tumores podrían presentarse sin ninguna a numerosas islas tumorales invadiendo el tejido conectivo (Figura5C-D). La Figura 5E-F representativa muestra el CAM cosechado en imágenes de campo brillante y fluorescencia fusionada. Células UM-SCC-1 que sobreexpresan el receptor de Galanin 2 presentaron una mayor invasión del DRG en comparación con las células de control (Figura5G-H). La interacción cáncer-DRG se observa como células cancerosas que presentan invasión direccional hacia el DRG (Figura5H).
El análisis de datos se realiza de diferentes maneras. La invasión direccional de las células cancerosas hacia el DRG se observa como una variable dicotómica y el número de óvulos que presentan este patrón de invasión se cuenta en cada grupo. Las diferencias estadísticas entre grupos se calculan utilizando una prueba binomial de proporciones. La proximidad entre las células cancerosas y el DRG, y el área del tumor se miden usando ImageJ6 y las diferencias entre los grupos se evalúan usando la prueba t del estudiante. Para garantizar la precisión con el análisis ImageJ, todas las imágenes del mismo experimento deben tomarse en los mismos ajustes de luz y exposición. Después de ajustar el umbral de imagen y el brillo de todas las imágenes utilizando los mismos criterios, la herramienta Analizar partículas se utiliza para medir el área del tumor y la herramienta de medición lineal mide las distancias tumor-DRG. Es importante utilizar la configuración constante del tamaño de las partículas analizadas para todas las imágenes en diferentes grupos. En algunos casos, los tumores crecen más gruesos y se pueden medir manualmente con una pinza digital, lo que permite una medición del volumen.
Se pueden realizar secciones de tejido CAM incrustado en parafina, manchas de H&E o inmunohistoquímica para células epiteliales (anticuerpos anticitoqueratinas reactivos para especies humanas), lo que permite evaluar la invasión dentro del tejido conectivo. La invasión se cuantifica como el número de islas tumorales en el tejido conectivo por huevo. La inmunofluorescencia para el colágeno IV se puede utilizar para resaltar la membrana del sótano. Además, si se utilizan células cancerosas etiquetadas con GFP, la identificación de estas células en las secciones tisulares se facilita sin una inmunohistoquímica para la citoqueratina. La metástasis y el análisis de la angiogénesis en experimentos CAM se discuten en otros lugares10,17.
Figura 1: Cronología del experimento, incluidos los pasos principales de los días 0, 8, 10 y 17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Extracción de DRG el día 8 . Un. Esquema de rata que ilustra la ubicación anatómica de la columna vertebral. B. Diagrama de la configuración de las vértebras de rata que muestra diferentes regiones del cuerpo; verde para el cuello uterino, azul oscuro para torácico, naranja para lumbar y azul claro para las vértebras sacras. C-D. Aspecto ventral de la columna vertebral de la rata después de la escisión quirúrgica; separación de las regiones como se ilustra en B. E. Disección de las vértebras para abrir el canal de la médula espinal, separando los cuerpos vertebrales en dos secciones laterales que contienen los DRG. F. Aspecto bruto de la columna torácica abierta. G. Después de desplazar la médula espinal, los DRG son fácilmente visibles en los canales vertebrales (cabezas de flecha que apuntan a 3 DRG). H. Imagen estereomicroscópica de un DRG (flecha) con los correspondientes haces de axón (cabeza de flecha). Barras de escala: C, D, F, y G, 1 cm; H, 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de los huevos el día 8. A-B. Identificación de la vasculatura de huevo y marcas antes del procedimiento. Flechas en Un punto al saco de aire natural. C-D. Perforación y apertura de la cáscara de huevo en la marca de apertura cuadrada. Flecha en D apunta a la membrana de la cáscara de huevo exterior intacta después de quitar la cáscara con la ayuda de fórceps contundentes. E. La cruz marcada en el saco de aire se perfora con el taladro para permitir el flujo de aire en el huevo (cabeza de flecha). 30 l de medio HBSS se coloca sobre la membrana exterior de la cáscara de huevo en la abertura cuadrada. F. Con una aguja de jeringa fina, la membrana exterior de la cáscara del huevo se perfora donde se colocó previamente el HBSS. G. La presión se aplica a una bombilla cuentagotas de goma mientras se une a la perforación perforada en el saco de aire. Cuando se libera la presión de los dedos, se aspira el aire, generando un saco de aire artificial (flechas blancas) que debe extenderse a la ventana de operación. H. Los bordes de la ventana de operación se perforan en una posición casi paralela a la cáscara del huevo, para evitar perforaciones accidentales. I-J. Eliminación de la cáscara de huevo con fórceps contundentes. K. Retire la membrana exterior de la cáscara de huevo con fórceps contundentes, teniendo cuidado de no introducir partículas en el CAM (observado a 1 cm por debajo de la superficie). L. Los huevos se cubren temporalmente con una membrana de cera de parafina y se vuelven a colocar en la incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Injerto de DRG, células, y cosecha de CAM: El día 8: A. CAM fácilmente observado después de la eliminación de la membrana de cera de parafina. B-C. Con fórceps finos, DRG se coloca en el CAM. D. El huevo está cubierto con aderezo de película y se pone en la incubadora; las flechas apuntan a las aberturas que están cubiertas. El día 10: E-F. Se retira el apósito de película y se encuentra DRG (cabeza de flecha en F). G-H. 5 l de solución celular se deja caer sobre el CAM a una distancia de 2 mm del DRG. En el día 17: I-L y M-P demuestran dos enfoques diferentes utilizados para cosechar el CAM. I. Cáscara de huevo se abre con una tijera fina que comienza en el saco de aire perforación perforada hasta que se retira la mitad superior del huevo. J. La cáscara de huevo que contiene el CAM se reduce en tamaño a aproximadamente 3 cm. K-L. Con fórceps finos, CAM se separa de la cáscara de huevo y se coloca en PFA. M-O. El ensanchamiento de la ventana de operación se realiza para visualizar el DRG y las células cancerosas en el CAM. Arrowhead apunta al tumor y la flecha apunta al DRG. P. El CAM se sujeta con fórceps finos, se corta con una tijera afilada y se coloca en PFA como se muestra en L. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos. A. Sección de H&E que muestra la integración del DRG en el CAM. B. Mayor aumento de A; flechas muestran los vasos sanguíneos CAM en el DRG. C. Células UM-SCC-1 injertadas en el CAM y cosechadas cuatro días después del injerto (mancha H&E). D. Mayor aumento de C que muestra islas tumorales invasivas en el tejido conectivo CAM (flechas). E. Imagen estereomicrocópica bruta del CAM injertado con células UM-SCC-1-GALR2 y DRG de rata, cosechada el día 17. F.Fluorescencia fusionada e imágenes de campo brillante que resaltan el DRG etiquetado en rojo y células cancerosas etiquetadas en verde. G-H. Estereomicroscopía por fluorescencia del CAM injertado con DRG y UM-SCC-1-GALR2 frente a las células de control, lo que ilustra la invasión direccional de células UM-SCC-1-GALR2 al DRG (H). Barras de escala: A-D, 500 m; E-H, 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Paso | Problema | Razón | Solución | ||||||
3.2.1 | Incapaz de identificar el accesorio embrionario. | La posición del accesorio es difícil de ver mientras el huevo está quieto. | Gire el huevo rápidamente hacia los lados para poder ver un vaso largo unido a la membrana del huevo. | ||||||
3.3 y 3.8 | Perforación de la membrana exterior de la cáscara de huevo durante la perforación. | Posicionamiento incorrecto del taladro. | Coloque el taladro casi paralelo a la cáscara de huevo durante la perforación. Si la membrana se perfora en el paso 3.3 , no hay necesidad de realizar perforaciones adicionales con la aguja como se indica en el paso 3.5. Si ocurre sangrado, deseche el óvulo. | ||||||
4.3 | DRG se adhiere a los fórceps. | DrG está seco. | Humedezca DRG de nuevo en HBSS y/o use una aguja fina para ayudar a separar el DRG de los fórceps. | ||||||
5.2 | Las células no están perfectamente etiquetadas con tinte fluorescente. | Tiempo de incubación. Algunas células requieren más tiempo para etiquetar. | Conservar las células durante una hora adicional en soportes con tinte fluorescente. | ||||||
5.6 | Burbuja de aire en la caída de la célula. | Usando todo el líquido en la punta de la pipeta. | Cargue 1 l más que el volumen deseado y no utilice el l final de la pipeta al implantar las células. Esto evitará que las burbujas de aire en la mezcla de células. | ||||||
6.3 | No se puede identificar DRG o células al cosechar el CAM. | Pequeño DRG, DRG se desplazó, las células cancerosas se propagaron. | Si no se ve DRG, cosecha un área más grande de la CAM y colócala en un recipiente más grande para la fijación. Compruebe la DRG y la posición de la célula bajo fluorescencia en un microscopio estéreo, y luego recorte el CAM a un tamaño más pequeño para la incrustación de parafina. |
Tabla 1: Tabla de solución de problemas
El modelo CAM-DRG in vivo presentado aquí aborda los déficits de modelos anteriores demostrando la interacción nervio-tumor antes de la invasión física del nervio por las células tumorales. Los estudios más in vivo de PNI se centran en la propagación tumoral y la inhibición de la función motora, y dependen de la inyección directa de células tumorales en los nervios ciáticos23,24,25. La inyección del nervio ciático es un modelo in vivo de PNI donde las células cancerosas se inyectan en un nervio ciático de ratón o rata donde el tumor crece posteriormente. Los modelos de inyección son útiles para mostrar la progresión del tumor destructivo y el dolor resultante de las células tumorales dentro de los nervios. El modelo de nervio ciático también es adecuado para el estudio de factores que permiten que las células cancerosas prosperen en el nervio pero carece de la capacidad de evaluar la fase temprana de la PNI, porque introduce las células directamente en el nervio, evitando las vainas nerviosas. En un enfoque diferente, se utilizaron injertos tumorales ortotópicos implantados quirúrgicamente para caracterizar la importancia de las fibras nerviosas adrenérgicas y colinérgicas en la promoción de la progresión del cáncer de próstata, lo que sugiere un papel prominente de los nervios en la progresión tumoral 26. Este modelo consistió en la ablación química de los nervios murinas simpáticos y parasimpáticos. Las fibras parasimpáticas se infiltraron en los tejidos tumorales, un proceso relacionado con la PNI, pero el modelo no se utilizó específicamente para evaluar las interacciones físicas entre el nervio y el tumor. El modelo CAM-DRG permite investigar las interacciones entre el nervio y el cáncer durante la PNI. Además, los modelos murinos son caros y consumen mucho tiempo en comparación con el modelo CAM. Sugerimos utilizar el modelo CAM-DRG para estudios mecánicos de PNI.
Algunas ventajas del enfoque CAM-DRG incluyen la evaluación de PNI y otros fenotipos, como el crecimiento tumoral, la metástasis y la angiogénesis. La identificación del ADN humano en la CAM inferior y/o en el hígado se puede utilizar para la detección de metástasis de las líneas celulares de cáncer humano10,un enfoque experimental más sensible en comparación con la sección y tinción de tejido, que puede no revelar pequeñas metástasis.
El método CAM-DRG tiene algunas limitaciones, incluyendo el marco de tiempo de observación corto. El sistema inmunitario del embrión es fisiológicamente activo para el día 1827,cuando el rechazo y un proceso inflamatorio pueden tener lugar, limitando el tiempo experimental. También es importante tener en cuenta la distancia al injertar células tumorales cerca del DRG; mayores distancias de cáncer de DRG podrían afectar las interacciones moleculares entre las células tumorales y los nervios, o podrían retrasar el contacto físico entre ambos componentes del modelo. Además, si los embriones son más antiguos de lo estipulado en este protocolo, los movimientos embrionarios podrían desplazar las células tumorales. Por lo tanto, es importante utilizar huevos consistentes con el día 10 después de la fertilización para el injerto celular.
Dado que el sistema inmunitario no está completamente desarrollado antes del día 1827,el microambiente tumoral en la CAM es similar al de los modelos murinos inmunosuprimidos que se utilizan a menudo para estudios oncológicos. Por lo tanto, este modelo no es útil para evaluar el papel de las células inmunitarias en la progresión tumoral. Otra limitación es la disponibilidad restringida de reactivos para especies de pollos, como anticuerpos, citoquinas e imprimaciones.
La realización precisa de este protocolo requiere práctica; sin embargo, puede ser hecho por un miembro del laboratorio sin necesidad de una instalación central especializada. La perforación de la cáscara de huevo requiere entrenamiento. Se recomienda practicar en huevos de alimentación (no fertilizados) antes de intentar este modelo por primera vez. Se puede lograr una alta supervivencia embrionaria y el éxito del modelo si se siguen algunos pasos críticos para evitar la infección: profilaxis antibiótica apropiada de DRGs en 2% Pen/Strep, trabajando en un gabinete de flujo laminar, y evitando la dispersión de partículas de cáscara de huevo en el CAM. También es crucial mantener la humedad estable durante el tiempo total de incubación del huevo. Recomendamos aumentar el número de huevos por grupo hasta que se domine la técnica. Los problemas más frecuentes para el personal de laboratorio inexperto son la contaminación por óvulos y la técnica inexacta para el injerto celular.
La recolección de DRG también requiere capacitación; práctica en la recolección de DRGs para experimentos in vitro8 antes de intentar el modelo in vivo se recomienda. El cultivo DRG in vitro es una oportunidad para optimizar las condiciones y mejorar la técnica para acortar la duración de la extracción de DRG. Se requiere especial atención a la técnica de cosecha al agarrar el DRG con fórceps. El DRG no debe ser retenido directamente; presión debe aplicarse debajo de ella. Recomendamos el uso de lente de aumento para visualizar mejor el DRG durante la extracción.
Es importante destacar que al realizar este modelo por primera vez, todas las condiciones deben optimizarse para la línea de celda deseada. Este modelo fue optimizado para DRG de rata y la línea de células HNC UM-SCC-1. El uso de DRG de ratón y otros tipos de células cancerosas puede requerir optimización. Con una mayor concentración de células injertadas, los tumores tienden a crecer más gruesos y rígidos, lo que facilita las mediciones tumorales. Teniendo en cuenta múltiples óvulos para cada grupo y una concentración adecuada de células para cada óvulo, pueden ser necesarios varios millones de células para cada experimento. Para facilitar la planificación, se debe tener en cuenta el conocimiento del tiempo de duplicación de las células. Para algunos pasos críticos en este protocolo, se proporciona una tabla de Troubleshooting (Tabla1).
Los autores no declaran intereses en competencia.
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH/NIDCR DE027551 y DE022567 (NJD).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
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