En automatiserad metod för att utföra Mikrokärnanalys in vitro med hjälp av Multispektral avbildning flödescytometri

In vitro-analys av mikrokärnor (MN) används ofta för att utvärdera cytotoxicitet och genotoxicitet men scoring analysen via manuell mikroskopi är mödosam och introducerar osäkerhet i resultaten på grund av variationer mellan SCORERS. För att avhjälpa detta har automatiserad bild skanning mikroskopi samt konventionella flödescytometri metoder införts i ett försök att ta bort målskytt bias och förbättra genomströmningen. Emellertid, dessa metoder har sina egna inneboende begränsningar såsom oförmåga att visualisera cytoplasman i cellen och avsaknaden av visuell MN verifiering eller bild datalagring med flödescytometri. Multispektrala Imaging Flow Cytometry (MIFC) har potential att övervinna dessa begränsningar. MIFC kombinerar den högupplösta fluorescerande bilden av mikroskopi med den statistiska robustheten och hastigheten hos konventionell flödescytometri. Dessutom kan alla insamlade bilder lagras i dosspecifika filer. Detta dokument beskriver det protokoll som utvecklats för att utföra en helt automatiserad version av MN-analysen på MIFC. Humana lymfoblastoid TK6 celler utvidgades med hjälp av en hypoton lösning (75 mM KCl), fast med 4% formalin och kärninnehållet färgas med Hoechst 33342. Alla prover kördes i suspension på MIFC, tillåter förvärv av högupplösta bilder av alla viktiga händelser som krävs för analysen (t. ex. binucleated celler med och utan MN samt mononukleerade och polynucleated celler). Bilder identifierades automatiskt, kategoriseras och räknas upp i MIFC dataanalysprogram vara, vilket möjliggör automatiserad bedömning av både cytotoxicitet och genotoxicitet. Resultaten visar att användning av MIFC för att utföra den in vitro-MN-analysen möjliggör statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvens som ska upptäckas vid flera olika nivåer av cytotoxicitet jämfört med kontroller av lösningsmedel efter exponering av TK6-celler för att Och kolkicin, och att inga signifikanta ökningar av MN-frekvensen observeras efter exponering för mannitol.