Dit werk werd gesteund door opstarten middelen aan TDG van Christopher Newport University.

1. voorbereiding van het gel
Opmerking: Voor de protocollen van de Elektroforese van het gel van de algemene, zie ook P.Y. Lee, et al.. 14.
<ol><li>Meng agarose (~ 1% w/v, percentage kan worden gevarieerd voor bepaalde grootte scheidingen) in buffer (ongeveer 70 mL voor een mini gel (8 x 7 cm)). Buffers zijn vaak TAE (tris-acetaat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM acetaat, 1 mM EDTA, pH ongeveer 8,6) of FSME (tris-boraat-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boraat, 2 mM EDTA, pH on...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O&#8217;Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange.">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li><li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes, Inc. , (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+induced+by+ultraviolet+light.">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li><li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light.">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).</li><li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies.">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li><li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis.">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li><li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA.">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li><li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Up+Probes:+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution.">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li><li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bisquinolinium/Thiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA.">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li><li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li></ol>

Ethidiumbromide is al lang een standaardhulpmiddel in de moleculaire biologie lab, ondanks bekende toxiciteit. Het lijdt ook waarbij UV-licht, die het DNA schade zoals het wordt ontdekt. Thiazole oranje biedt een goedkoop alternatief voor ethidiumbromide, evenals nuttig, maar dure commerciële kleurstoffen.
De voordelen van thiazole oranje zijn dus tweeledig. Eerst, thiazole oranje kan gewoon worden gebruikt als vervanging aan ethidiumbromide. Gels kunnen identiek aan EtBr, met aan vervangen a...

Het doel van deze methode is om te identificeren van DNA in agarose gel met behulp van thiazole oranje (TO) voor de detectie van de fluorescentie. Door zijn lage kosten en gunstige veiligheidsprofiel, kan thiazole oranje bepaald voordeel in undergraduate onderwijs labs en onderzoeklaboratoria uitvoeren van moleculaire biologie, met name ligations en klonen ziet.
Ethidiumbromide blijft de meest voorkomende kleurstof voor opsporing van DNA in agarose gel. Dit is vooral omdat het zeer goedkoop kan worden verkregen en vereist alleen excitatie met UV-licht voor detectie. Beide ethidium bromide en thiazole oranje zijn goedkoop, met lage detectie limieten (1-2 ng/lane)1. Er zijn twee belangrijke nadelen aan ethidiumbromide, echter dat thiazole oranje verbetert.
Eerst, ethidiumbromide is een mutagen2 met speciale verwerking en verzending en over verwijdering eisen, terwijl thiazole oranje minder mutagene is (3-4 x minder mutageen in Ames-test)3,4 en kan worden over het algemeen afgezet met gemeenschappelijke chemisch afval.
Ten tweede vereist ethidiumbromide UV-licht voor detectie. Thiazole oranje ook UV-licht kunt gebruiken, indien gewenst, maar kan ook worden gedetecteerd met blauw licht. UV-licht, heeft terwijl gebruikte, een paar saillante nadelen. Ten eerste, het is schadelijk voor de menselijke huid en ogen. Hoewel UV-licht kan veilig gebruikt worden door daartoe opgeleide beroepsbeoefenaren, schade door een ongeluk huid of oog (functioneel vergelijkbaar met zonnebrand) uit laboratorium UV licht zijn niet ongewoon vooral met onervaren wetenschappers. Ten tweede, UV-licht is uiterst schadelijk voor DNA monsters5, waardoor het succes van downstream experimenten (zoals afbinding en transformatie)1,6,7. AAN maakt de ontdekking met blauw licht (λex, max = 510 nm (488 nm en 470 nm Toon ook sterke excitatie)), die veroorzaakt geen huid schade of DNA schade (hoewel een intens licht kan nog steeds schadelijk voor de ogen), sterk verminderen van de risico's voor zowel de wetenschapper en het monster.
Is niet het slechts fluorescente kleurstof alternatief voor ethidiumbromide; het voordeel is kosten. AAN werd ontdekt in de jaren 1980 als een Retikulocyt vlek8, en nut heeft gevonden in een aantal DNA gebaseerde fluorescentie experimenten9,10,11,12,13. Het is op dit moment verkocht door meerdere leveranciers. Is de bovenliggende compound van extra, duurder, blauw-licht-detecteerbare commerciële kleurstoffen en zich gedraagt als tijdens elektroforese, met behulp van UV- of blauw licht voor detectie1. Bovendien, terwijl andere kleurstoffen gevoeliger voor zeer lage concentraties van DNA dan EtBr of aan, voor generieke elektroforese experimenten zijn, dergelijke kleurstoffen zijn onbetaalbaar in vele contexten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

DNA gelelektroforese met behulp van agarose is een gemeenschappelijk instrument in moleculaire biologie laboratoria, waarmee een scheiding van de fragmenten van DNA door grootte. Na scheiding, is DNA gevisualiseerd door kleuring. Dit artikel laat zien hoe u thiazole oranje om vlek DNA. Thiazole oranje vergeleken gunstig met gemeenschappelijke kleuring methoden, in die zin dat het gevoelige, goedkope, prikkelbaar met UV- of blauw licht (monster om schade te voorkomen) en veiliger dan ethidiumbromide. Laboratoria die reeds uitgerust is om uit te voeren van de experimenten van DNA elektroforese gebruik van ethidiumbromide kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen in het algemeen overschakelen naar bestaande protocollen, met behulp van UV-licht voor detectie. Blauw-licht detectie om te voorkomen dat monster schade kan bovendien worden bereikt met een blauw-licht bron en emissie-filter. Labs reeds uitgerust voor blauw-licht detectie kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen eenvoudig overschakelen naar bestaande protocollen.

Thiazole oranje maakt detectie van DNA, zonder gebruik van ethidiumbromide en zonder gebruik te maken van DNA-schadelijk UV-licht. Ethidiumbromide is bekend als mutageen, dus het wegwerken van het lab voordeel kan opleveren. UV-licht beschadigt DNA en verlaagt transformatie-efficiëntie aanzienlijk, terwijl blauw licht DNA niet beschadigt. Detectiegrenzen lijken tussen ethidiumbromide, thiazole oranje en een gemeenschappelijke, blauw-licht-detecteerbare commerciële DNA kleurstof (Figuur 1, ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes at JoVE.com

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Dit protocol is een eenvoudig en goedkoop alternatief voor het gebruik van ethidium bromide voor DNA-detectie tijdens elektroforese. Door het verwijderen van ethidium bromide, ofwel UV-licht of blauw licht kan worden gebruikt voor detectie. Blauw licht is niet schadelijk voor DNA, wat de kans op succes voor downstream experimenten verbetert.Het is echt gemakkelijk om dit uit te proberen. Je hoeft alleen maar de ethidium bromide in je gels te vervangen door thiazool oranje. Om te beginnen, bereiden 1%mini-gels door het mengen van ongeveer 0,7 gram agarose in 70 milliliter tris-acetaat-EDTA of tris-borate buffers.Los vervolgens thiazool oranje op in DMSO om een 10,000X voorraadoplossing te maken. Hoewel niet bijzonder lichtgevoelig, bewaar thiazool oranje in het donker wanneer niet in gebruik. Voor langdurige opslag, maak aliquots van de thiazool oranje-DMSO mengsel en bevriezen.Voeg vervolgens thiazool oranje toe aan een laatste concentratie van 1,3 microgram per milliliter en magnetron het mengsel van agarosebuffer en thiazool sinaasappel om agarose ongeveer 60 seconden op te lossen. Giet het agarosemengsel in een gelgieapparaat met een geschikte kam en laat de agarose-oplossing stollen in een gel. Om de gel te laden, plaats eerst de gel in het elektroforeseapparaat, indien niet reeds aanwezig.Voeg vervolgens TAE of TBE running buffer toe om het oppervlak van de gel te bedekken. Vervolgens, met behulp van een lading kleurstof, laden 10 microliter van een DNA-monster. Voeg een DNA-formaat ladder ter referentie.Bevestig de hoes en elektroden, en voer de mini-gel op 100 volt tot de lading kleurstof reist ongeveer vier tot zeven centimeter voor een mini-gel. Als thiazool sinaasappel niet werd aangebracht voorafgaand aan gel gieten, vlek de gel door het onder te dompelen in de buffer met thiazool oranje met zachte agitatie voor ongeveer 20 minuten of totdat de banden volledig zijn gedetecteerd. Om de gel te visualiseren met behulp van een UV-transilluminator, verwijdert u de gel uit het elektroforeseapparaat en plaatst u deze op de UV-transilluminator.Om de gel te visualiseren met behulp van een blauw licht transilluminator of een zaklamp, plaats de gel op de blauwe lichttransilluminator of richt de blauwe LED-zaklamp op de gel van boven of onder. Gebruik een amber emissiefilter om het blauwe licht eruit te filteren, waardoor fluorescentie uit DNA thiazool sinaasappelcomplexen kan worden gevisualiseerd en kleurstoffen kunnen worden beschermd. Voor verdere vertering of ligatie, uitgesneden gewenste DNA-banden uit de gel en ga naar het extraheren van DNA met behulp van een direct beschikbare kit of protocol.Selecteer de juiste excitatie- en emissie-instellingen in het gel-imaging-apparaat. Bij afwezigheid van een beeldvormingssysteem met de juiste filters, plaatst u een oranje filter tussen de camera en de gel blue-light excitatiebron. Detectie grenzen zijn vergelijkbaar tussen ethidium bromide, thiazool sinaasappel, en een gemeenschappelijke blauw-licht-detecteerbare commerciële DNA-kleurstof, met de detectie limiet voor alle drie de kleurstoffen zijn een tot twee nanogram per rijstrook in een mini-gel.Thiazole oranje gekleurde agarose gel van een beperking verteren is detecteerbaar wanneer het wordt opgewekt met een UV of een blauw licht transilluminator of met een blauw licht zaklamp. Hoewel thiazool oranje minder gevaarlijk lijkt te zijn dan ethidium bromide, moeten standaard persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en brillen nog steeds worden gedragen.