עבודה זו נתמכה על ידי קרנות אתחול כדי TDG מ אוניברסיטת ניופורט כריסטופר.

1. מכינים את הג'ל
הערה: עבור כללי ג'ל אלקטרופורזה פרוטוקולים, ראה גם לי פ, ואח. 14.
<ol><li>לערבב agarose (~ 1% w/v, אחוז יכולים להיות מגוונים להפרדות גודל מסוים) במאגר (כ 70 מ עבור ג'ל מיני (8 x 7 ס מ)). מאגרי הם בדרך כלל טה (טריס-אצטט-EDTA, 40 מ מ טריס, אצטט 20 מ מ, 1 מ מ EDTA, pH כ 8.6) או TBE (טר...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O&#8217;Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange.">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li><li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes, Inc. , (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+induced+by+ultraviolet+light.">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li><li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light.">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).</li><li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies.">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li><li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis.">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li><li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA.">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li><li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Up+Probes:+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution.">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li><li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bisquinolinium/Thiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA.">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li><li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li></ol>

אתידיום ברומיד כבר זמן רב כלי תקני במעבדה בביולוגיה מולקולרית, למרות ידועה רעילות. זה גם סובל הדורשים אור UV, אשר פוגעת הדנ א כמו זה להיות מזוהה. Thiazole תפוז מציע אלטרנטיבה זולה אתידיום ברומיד, כמו גם צבע מסחרי שימושי אך יקר.
היתרונות של thiazole תפוז הם לפיכך כפולה. ראשית, ניתן להשתמ...

מטרת שיטה זו היא לזהות את הדנ א של ג'לים agarose באמצעות thiazole כתום (כדי) לגילוי קרינה פלואורסצנטית. עקב פרופיל בטיחות בעלות נמוכה מאהדה שלה, thiazole כתום עשויים לראות תועלת מסוימת הוראה לתואר ראשון מעבדות, מעבדות מחקר, ביצוע בביולוגיה מולקולרית, בעיקר ligations ו שיבוט.
אתידיום ברומיד נשאר הצבע הנפוץ ביותר עבור זיהוי ה-DNA agarose ג'ל. זה בעיקר כי ניתן להשיג בזול מאוד, רק דורש עירור עם אור UV לצורך זיהוי. שניהם אתידיום ברומיד, thiazole כתום זולים, עם זיהוי נמוך מגבלות (1-2 ng/ליין)1. שני חסרונות עיקריים אתידיום ברומיד, עם זאת, המשפר thiazole כתום על.
ראשית, אתידיום ברומיד הוא מוטגן2 עם טיפול מיוחד, משלוח ודרישות סילוק, ואילו thiazole כתום הוא פחות מוטגן (3-4 x פחות כגורמי מוטציה במבחן איימס)3,4 , ניתן באופן כללי להמית עם פסולת כימית נפוצות.
שנית, אתידיום ברומיד דורש אור UV לצורך זיהוי. Thiazole כתום באופן דומה ניתן להשתמש אור UV אם רצונך בכך, אך ניתן לזהות גם עם אור כחול. אור UV, בעוד בשימוש נפוץ, יש כמה חסרונות הבולטות. ראשית, הוא נחשב כמזיק עור ועיניים. בעוד אור UV ניתן להשתמש בבטחה על ידי אנשי מקצוע מיומנים, העור או עין נזק מקרי (בדומה פונקציונלית כוויות שמש) ממעבדה UV אור אינן נדירות במיוחד עם מדענים לא מנוסים. שנית, אור UV מזיק מאוד ל- DNA דגימות5, אשר מפחית את ההצלחה של ניסויים במורד הזרם (כגון מצדו טרנספורמציה)1,6,7. אל מאפשר זיהוי עם אור כחול (λלשעבר, מקסימום = 510 ננומטר (488 ננומטר, 470 nm גם להראות עירור חזק)), אשר אינו גורם נזק לעור או DNA נזק (למרות כל אור אינטנסיבי עשוי עדיין להיות מזיקה לעיניים), להקטין באופן משמעותי את הסיכונים להם שני המדען את הדגימה.
היא לא החלופה רק הפלורסנט אתידיום ברומיד; היתרון שלו הוא העלות. כדי התגלה בשנות ה-80 כמו כתם רטיקולוציט8, מצא השירות במספר של זריחה מבוסס DNA ניסויים9,10,11,12,13. הוא נמכר כעת על-ידי ספקים מרובים. כדי הוא מתחם הורים נוספים, יקר יותר, צבע כחול-אור – לזיהוי מסחרי, מתנהג בדומה במהלך אלקטרופורזה, באמצעות UV או אור כחול עבור זיהוי1. יתר על כן, בעוד צבעים אחרים רגישים נמוך מאוד ריכוזי ה-DNA יותר EtBr או אל, לניסויים אלקטרופורזה כלליים, כגון צבעי הם לחדשו בהקשרים רבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

דנ א בג'ל באמצעות agarose הוא כלי נפוץ במעבדות בביולוגיה מולקולרית, המאפשר הפרדה בין שברי DNA לפי גודל. לאחר ההפרדה, ה-DNA הוא מדמיין מאת מכתים. מאמר זה מדגים כיצד להשתמש DNA thiazole כתום כתם. Thiazole תפוז משווה לטובה לשיטות מכתימים נפוצות, בכך שהוא רגיש, זול, להתרגש עם UV או אור כחול (כדי למנוע נזק לדוגמה), ובטוחה יותר אתידיום ברומיד. מעבדות מצוידים כבר להפעלת ה-DNA אלקטרופורזה ניסויים באמצעות אתידיום ברומיד יכול לעבור בדרך כלל צבעי ללא שינויים נוספים הפרוטוקולים הקיימים, באמצעות אור UV לגילוי. בנוסף ניתן להשיג גילוי אור כחול כדי למנוע נזק מדגם עם מסנן המקור, פליטת אור כחול. מעבדות מצוידים כבר לגילוי אור כחול ניתן לעבור פשוט צבע ללא שינויים נוספים הפרוטוקולים הקיימים.

Thiazole תפוז מאפשר זיהוי של ה-DNA, ללא שימוש אתידיום ברומיד, ולא באמצעות אור UV מזיקות-DNA. אתידיום ברומיד ידוע להיות מוטגן, כך ולהוצאתה מהמעבדה עשוי להיות יתרון. אור UV מזיקה דנ א, מוריד את יעילות ההמרה באופן משמעותי, בעוד אור כחול אינו גורם נזק הדנ א. איתור מגבלות דומות בין אתידיום ברומיד, כתום thiazole ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes at JoVE.com

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

פרוטוקול זה הוא חלופה קלה וזולה לשימוש באתידיום ברומיד לגילוי DNA במהלך אלקטרופורזה. על ידי הסרת אתידיום ברומיד, אור UV או אור כחול יכול לשמש לגילוי. אור כחול אינו מזיק לדנ"א, מה שמגדיל את הסיכוי להצלחה בניסויים במורד הזרם.זה ממש קל לנסות את זה. אתה רק צריך להחליף את האתידיום ברומיד בג'ל שלך עם תפוז תיאזולה. ראשית, הכינו 1%mini-gels על ידי ערבוב של כ-0.7 גרם אגרוז ב-70 מיליליטר של מאגרי טריס-אצטט-אדטה או טריס-בוראט.לאחר מכן, להמיס כתום thiazole ב DMSO כדי להפוך את פתרון 10, 000X מניות. אמנם לא רגיש לאור במיוחד, לאחסן כתום thiazole בחושך כאשר לא בשימוש. לאחסון לטווח ארוך, הכינו אליקוטים מתערובת התיאזול הכתום-DMSO והקפיאו אותם.לאחר מכן, מוסיפים כתום תיאזול לריכוז סופי של 1.3 מיקרוגרם למיליליטר, ומכניסים במיקרוגל את התערובת של חיץ אגרוז ותפוז תיאזולה כדי להמיס אגרוז במשך כ -60 שניות. יוצקים את תערובת אגרוז לתוך מנגנון יציקת ג'ל המכיל מסרק מתאים, ולאפשר את הפתרון agarose להתגבש לתוך ג'ל. כדי לטעון את הג'ל, ראשית למקם את הג'ל במנגנוני אלקטרופורזה, אם לא כבר נוכח.לאחר מכן הוסיפו את מאגר הריצה TAE או TBE לכיסוי פני השטח של הג'ל. לאחר מכן, באמצעות צבע טעינה, לטעון 10 microliters של דגימת DNA. כלול סולם שינוי גודל DNA לעיון.חבר את הכיסוי ואת האלקטרודות, ולהפעיל את מיני ג'ל ב 100 וולט עד צבע הטעינה נע כארבעה עד שבעה סנטימטרים עבור מיני ג'ל. אם תפוז תיאזולה לא הוחל לפני יציקת ג'ל, הכתם את הג'ל על ידי טבילתו במאגר המכיל תפוז תיאזולה עם תסיסה עדינה במשך כ -20 דקות או עד שהרצועות מזוהות במלואן. כדי לדמיין את הג'ל באמצעות טרנסילומינטור UV, הסר את הג'ל ממנגנוני האלקטרופורזה והצב אותו על טרנסילומינטור UV.כדי לדמיין את הג'ל באמצעות transilluminator אור כחול או פנס, מניחים את הג'ל על transilluminator אור כחול או לכוון את פנס LED כחול על הג'ל מלמעלה או מתחת. השתמש במסנן פליטת ענבר כדי לסנן את האור הכחול, המאפשר הדמיה של פלואורסצנטיות מתסביך כתום תיזול DNA ולהגן על צבעים. לעיכול נוסף או קשירה, לגזור רצועות DNA הרצוי מן הג'ל ולהמשיך לחלץ DNA באמצעות ערכה זמינה או פרוטוקול.בחר את הגדרות העירור וההפלה המתאימות במנגנוני הדמיית הג'ל. בהיעדר מערכת הדמיה עם מסננים מתאימים, מקם מסנן ענבר בין המצלמה למקור העירור של האור הכחול. מגבלות הגילוי דומות בין אתידיום ברומיד, תפוז תיאזול וצבע דנ"א מסחרי נפוץ לגילוי אור כחול, כאשר מגבלת הגילוי של כל שלושת הצבעים היא ננוגרם אחד עד שניים לכל נתיב במיני ג'ל.ג'ל אגרוז מוכתם בכתום של תקציר הגבלה ניתן לגילוי כאשר הוא מתרגש עם UV או טרנסילומינטור אור כחול או עם פנס אור כחול. בעוד כתום thiazole נראה פחות מסוכן מאשר ברומיד אתידיום, ציוד מגן אישי סטנדרטי כגון כפפות ומ המשקפיים עדיין צריך להיות משוחק.