Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Resumo

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Resumo

A microscopia da localização da único-molécula sonda a posição e os movimentos de moléculas individuais em pilhas vivas com dezenas de definição temporal espacial e milisecond do nanômetro. Estas capacidades fazem a microscopia da localização da único-molécula serida idealmente para estudar funções biológicas do nível molecular em ambientes fisiologicamente relevantes. Aqui, demonstramos um protocolo integrado para aquisição e processamento/análise de dados de rastreamento de molécula única para extrair os diferentes Estados diffusivos que uma proteína de interesse pode expor. Esta informação pode ser usada para quantificar a formação complexa molecular em células vivas. Fornecemos uma descrição detalhada de uma experiência de localização de molécula 3D baseada em câmera, bem como as etapas subseqüentes de processamento de dados que produzem as trajetórias de moléculas individuais. Essas trajetórias são então analisadas por meio de uma estrutura de análise numérica para extrair os Estados difusivos prevalentes das moléculas rotuladas fluorescentamente e a abundância relativa desses Estados. A estrutura de análise é baseada em simulações estocásticas de trajetórias de difusão brownianas intracelulares que são confinadas espacialmente por uma geometria de célula arbitrária. Com base nas trajetórias simuladas, as imagens de molécula única bruta são geradas e analisadas da mesma forma que as imagens experimentais. Dessa forma, as limitações experimentais de precisão e precisão, que são difíceis de calibrar experimentalmente, são explicitamente incorporadas ao fluxo de trabalho de análise. O coeficiente de difusão e as frações populacionais relativas dos Estados diffusivos prevalentes são determinados ajustando-se as distribuições dos valores experimentais utilizando combinações lineares de distribuições simuladas. Nós demonstramos a utilidade de nosso protocolo resolvendo os Estados difusivo de uma proteína que exiba Estados difusivo diferentes em cima de formar complexos do Homo-e do hetero-oligomeric no citosol de um micróbio patogénico bacteriano.

Introdução

Examinar o comportamento difusivo de biomoléculas fornece a introspecção em suas funções biológicas. Técnicas baseadas em microscopia de fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar biomoléculas em seu ambiente de células nativas. A recuperação da fluorescência após o photobranqueamento (Frap) e a espectroscopia da correlação da fluorescência (FCS)¹ fornecem comportamentos difusivo Ensemble-calculados. Inversamente, a microscopia da localização da único-molécula permite a observação de moléculas cDNAs etiquetadas individuais com definição espacial e temporal elevada^2,3,4....

Protocolo

1. calibração do ponto-propagação-função da dobro-hélice

Nota: as imagens descritas neste e as secções seguintes são adquiridas através de um microscópio de fluorescência invertido personalizado, conforme descrito em rocha et al.²³. O mesmo procedimento é aplicável às implementações diferentes do microscópio projetadas para a localização da único-molécula e a microscopia de seguimento^2,3,4. Todos os softwares para aquisição de imagens e processamento de dados descritos neste artigo estão disponíveis (https://github.com/Gahlman....

Discussão

Um fator crítico para a aplicação bem sucedida do protocolo apresentado é assegurar-se de que os sinais da único-molécula estejam bem separados de se (isto é, precisam de ser esparsos no espaço e no tempo (Mov. 1 suplementar)). Se houver mais de uma molécula fluorescente em uma célula ao mesmo tempo, então a localização pode ser incorretamente atribuída à trajetória de outras moléculas. Isto é referido como o problema de ligação³⁰. As condições experimentais,.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.