Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Die analytische Größenausschlusschromatographie (SEC), die häufig zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen und Protein-Protein-Komplexen in Lösung verwendet wird, ist eine relative Technik, die sich auf das Elutionsvolumen des Analyten stützt, um molekulare gewicht. Wenn das Protein nicht kugelförmig ist oder nicht-ideale Säulenwechselwirkungen durchläuft, ist die Kalibrierkurve auf der Grundlage von Proteinstandards ungültig, und das aus dem Elutionsvolumen ermittelte Molekulargewicht ist falsch. Multi-Winkel-Lichtstreuung (MALS) ist eine absolute Technik, die das Molekulargewicht eines Analyten in Lösung aus grundlegenden physikalischen Gleichungen bestimmt. Die Kombination von SEC zur Trennung mit MALS zur Analyse stellt ein vielseitiges, zuverlässiges Mittel zur Charakterisierung von Lösungen einer oder mehrerer Proteinarten dar, einschließlich Monomeren, nativen Oligomeren oder Aggregaten und Heterokomplexen. Da die Messung bei jedem Elutionsvolumen durchgeführt wird, kann SEC-MALS bestimmen, ob ein eluierender Peak homogen oder heterogen ist, und zwischen einer festen Molekulargewichtsverteilung im Vergleich zum dynamischen Gleichgewicht unterscheiden. Die Analyse modifizierter Proteine wie Glykoproteine oder Lipoproteine oder Konjugate wie Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ist ebenfalls möglich. Daher ist SEC-MALS ein wichtiges Werkzeug für den Proteinchemiker, der die biophysikalischen Eigenschaften und das Lösungsverhalten von Molekülen bestätigen muss, die für die biologische oder biotechnologische Forschung produziert werden. Dieses Protokoll für SEC-MALS analysiert das Molekulargewicht und die Größe reiner Proteinmonomere und -aggregate. Die gewonnenen Daten dienen als Grundlage für weitere SEC-MALS-Analysen, einschließlich der von Komplexen, Glykoproteinen und Tensid-gebundenen Membranproteinen.