Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytisk storlek-uteslutningskromatografi (SEC), som vanligen används för bestämning av molekyl vikten hos proteiner och protein komplex i lösning, är en relativ teknik som förlitar sig på analyternas elutionsvolym för att uppskatta molekyl ära Vikt. När proteinet inte är globulärt eller genomgår icke-ideala kolonninteraktioner är kalibrerings kurvan baserad på protein standarderna ogiltig, och den molekyl vikt som bestäms av elutionsvolymen är felaktig. Flervinkelljus spridning (MALS) är en absolut teknik som bestämmer molekyl vikten för en analyt i lösning från grundläggande fysikaliska ekvationer. Kombinationen av SEC för separation med MALS för analys utgör en mångsidig, pålitlig metod för att karakterisera lösningar av en eller flera protein arter inklusive monomerer, infödda oligomerer eller aggregat, och heterokomplex. Eftersom mätningen utförs vid varje elutionsvolym kan SEC-MALS avgöra om en elueringstopp är homogen eller heterogen och skiljer mellan en fast molekyl viktfördelning kontra dynamisk jämvikt. Det är också möjligt att analysera modifierade proteiner som glykoproteiner eller lipoproteiner, eller konjugat som lösnings medels lösliga membran proteiner. Därför är SEC-MALS ett kritiskt verktyg för proteinkemisten som måste bekräfta de biofysiska egenskaperna och lösnings beteendet hos molekyler som produceras för biologisk eller bioteknologisk forskning. Detta protokoll för SEC-MALS analyserar molekyl vikt och storlek av rena proteinmonomerer och aggregat. De data som förvärvas fungerar som en grund för ytterligare SEC-MALS analyser inklusive de av komplex, glykoproteiner och tensider-bundna membran proteiner.